pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin
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产品编号 D2882-100μg
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¥ 1169.00
产品包装:
1μg 100μg
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pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin是碧云天研发的以毕赤酵母(Pichia pastoris)为表达菌株、利用α factor分泌表达C端带有His标签的目的蛋白的真核表达质粒。在多克隆位点(Multiple cloning sites, MCS)按照读码框插入不带有终止密码子的目的基因,就可以表达C端带有His标签的目的蛋白。

毕赤酵母作为蛋白真核表达系统有很多优势:有助于蛋白正确折叠、翻译后修饰及易于操作等。与昆虫表达系统和哺乳动物细胞表达系统相比,它快速、高效且经济,通常外源蛋白还具有较高的表达水平。与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相比,其外源蛋白表达水平往往高10-100倍,它们均能进行分泌蛋白的N-连接糖苷键修饰,糖基化修饰时糖链长度是有差别的,毕赤酵母修饰的分泌蛋白的糖链长度通常是8-14甘露糖残基(Mannose residue),而酿酒酵母修饰的分泌蛋白的糖链长度通常是50-150个甘露糖残基;毕赤酵母很少对分泌蛋白进行O-连接糖苷键的修饰。

本质粒转化X-33, SMD1168H或KM71菌株后,因为宿主菌有功能完好的组氨酸脱氢酶基因,适合进行Zeocin筛选转化子,并能使目的基因在甲醇诱导后实现高水平表达。常用的毕赤酵母宿主菌GS115 (D0412)KM71 (D0413),二者的组氨酸脱氢酶基因(his4)发生突变,阻止它们合成组氨酸,因此具有His4-营养缺陷标记,适合在组氨酸缺少的培养基进行转化子筛选。GS115/X-33/ SMD1168H菌株具有功能完整的AOX1基因,属于Mut+ (Methanol utilization plus)表型,即甲醇利用正常,在甲醇诱导的情况下生产快速。而KM71/KM71H菌株的AOX1位点被ARG4基因插入破坏,表型为Muts (Methanol utilization slow),即甲醇利用缓慢,在甲醇诱导的情况下生产缓慢。

本质粒5'端含有醇氧化酶基因AOX1启动子,可以高效启动目的基因的表达。在毕赤酵母中,AOX1启动子属于甲醇诱导型强启动子,其严格依赖于甲醇的诱导,并受葡萄糖、果糖、甘油、乙醇等碳源的抑制,因此可通过控制葡萄糖、甘油等碳源的消耗和甲醇的流加来调控AOX1启动子的表达。

本质粒含有酿酒酵母的α-factor信号肽,用于引导目的蛋白的分泌表达。α-factor信号肽引导目的蛋白进入分泌通路后,Kex2基因编码的类枯草菌素蛋白酶(Subtilisin-like protease)识别α-factor C末端的EKREAEA序列,并在KR之后进行剪切,这样目的蛋白N端会携带4个氨基酸残基(EAEA),此时可能被Ste13基因编码的二肽蛋白酶氨基肽酶A (Dipeptidyl aminopeptidase A)识别EAEA基序并切割,因此分泌到胞外的目的蛋白的N端可能会残留2-4个氨基酸残基。

本质粒为Zeocin (博来霉素)抗性。博来霉素(ST1450)抗性可用于大肠杆菌和酵母的筛选,大肠杆菌筛选推荐浓度为25-50μg/ml (低盐LB培养基,NaCl浓度不能超过5g/L),酵母筛选推荐浓度为50-300μg/ml (YPD或基本培养基)。

pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin质粒(3529bp)的图谱如下:

pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AOX1 promoter 2..940
α-factor secretion signal 941..1207
6×His 1256..1273
AOX1 terminator 1353..1599
TEF1 promoter 1614..2025
EM7 promoter 2033..2080
BleoR 2099..2473
CYC1 terminator 2539..2786
ori 2861..3449

pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2882 pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin.pdf

pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AccIII Acc16I Acc36I Acc113I AcvI
AfeI AflII AhdI AhlI AjuI AloI Aor13HI
Aor51HI AscI AsiSI AspI Asp700I AspA2I AspEI
AviII AvrII AxyI BaeI BanIII BarI BbeI
BbrPI BbvCI BcgI BcuI BfrI BfuAI BlnI
BmcAI BmeRI BoxI Bpu10I BpvUI Bsa29I BsaAI
Bse21I BseAI BseCI BsgI BshVI BsmBI Bsp13I
Bsp68I BspDI BspEI BspMI BspQI BspTI BspXI
BssNAI Bst98I Bst1107I BstAFI BstBAI BstEII BstENI
BstHPI BstPI BstPAI BstSNI BstZ17I Bsu15I Bsu36I
BsuTUI BtsαI BtuMI BveI CciNI Cfr42I ClaI
CpoI CspI CspCI DinI DriI Eam1105I Eco47III
Eco72I Eco81I Eco91I Eco105I EcoNI EcoO65I EgeI
EheI Esp3I FalI FspI FspAI HpaI I-CeuI
I-PpoI I-SceI KasI Kpn2I KspI KspAI LguI
Mly113I MreI MroI MroXI MspCI NarI NotI
NruI NsbI PacI PalAI PasI PciSI PdmI
PflFI PI-PspI PI-SceI Ple19I PluTI PmaCI PmlI
Ppu21I PshAI PspCI PspEI PspXI PsrI PstI
PsyI PvuI RgaI RruI RsrII Rsr2I SacII
SapI SbfI ScaI SdaI SfaAI SfiI SfoI
Sfr303I SgfI SgrBI SgrDI SgsI SmiI SnaBI
SpeI SrfI Sse8387I SspI SspDI SstII SwaI
TsoI TstI Tth111I Vha464I XagI XmaJI XmnI
ZrmI

pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin中的单酶切位点包括:

AatII Acc65I AccI AgeI AleI AlwNI ApaI
BamHI BglII BlpI BmrI BmtI BseYI BsiWI
BsrDI BsrGI BssHII BssSI BstAPI BstBI BstXI
BtgZI DraI DraIII EagI Eco53kI EcoRI EcoRV
FseI HaeII HindIII KpnI MfeI MluI MscI
MslI NcoI NdeI NheI NsiI PaeR7I PciI
PflMI PmeI PsiI PspOMI PvuII SacI SalI
SexAI SgrAI SmaI SphI StuI StyI TspMI
XbaI XcmI XhoI XmaI ZraI

pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin质粒可使用的测序引物序列如下:

5' AOX1 sequencing primer (855-875): 5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'

3' AOX1 sequencing primer (1359-1379): 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'

pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin的全序列信息:D2882 pAOX1-α factor-MCS-His- Zeocin 全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2882-1µg pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin 1µg
D2882-100µg pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pAOX1-α factor-MCS-His-Zeocin质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。
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