pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有HA标签(HA Tag, YPYDVPDYA)的目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和博来霉素(Zeocin)抗性基因的表达质粒。
本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达；可以方便地使用抗HA的抗体(AF5057/AF2305/AF0039/AH158)来检测目的蛋白；同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP，便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。
图1. 碧云天pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。本图仅供参考，实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。
本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率 [1,2]。
本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和博来霉素(Zeocin)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后， 可使用Zeocin (ST1450)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| AmpR | 63-923 |
| AmpR promoter | 924-1016 |
| CMV enhancer | 1101-1404 |
| CMV promoter | 1405-1608 |
| T3 promoter | 1654-1672 |
| HA | 1712-1738 |
| P2A | 1808-1873 |
| EGFP | 1874-2593 |
| T7 promoter | 2645-2663 |
| SV40 poly(A) signal | 2937-3058 |
| f1 ori | 3065-3520 |
| AmpR promoter | 3547-3651 |
| SV40 promoter | 3653-4010 |
| SV40 ori | 3861-3996 |
| BleoR | 4045-4419 |
| HSV TK poly(A) signal | 4651-4698 |
| ori | 5027-5615 |
pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒(5723bp)的图谱如下：
pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo的多克隆位点的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo.pdf。
pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo中没有的酶切位点包括：
| AarI | AbsI | AccIII | AcvI | AfeI | AflII | AgeI |
| Aor13HI | Aor51HI | AscI | AsiGI | AsiSI | AspI | BaeI |
| BbeI | BbrPI | BbsI | BbvCI | BfrI | BlpI | BoxI |
| BpiI | Bpu1102I | BpuAI | BseAI | BshTI | BsiWI | Bsp13I |
| Bsp68I | Bsp1720I | BspEI | BspQI | BspTI | BssNAI | Bst98I |
| Bst1107I | BstAFI | BstEII | BstENI | BstPI | BstPAI | BstV2I |
| BstXI | BstZ17I | BtuMI | CelII | Cfr42I | CpoI | CspI |
| CspAI | DinI | Eco47III | Eco72I | Eco91I | EcoNI | EcoO65I |
| EgeI | EheI | FspAI | I-CeuI | I-PpoI | I-SceI | KasI |
| Kpn2I | KspI | LguI | Mly113I | MreI | MroI | MspCI |
| MssI | NarI | NruI | PalAI | PciSI | Pfl23II | PflFI |
| PI-PspI | PI-SceI | PinAI | PluTI | PmaCI | PmeI | PmlI |
| PpuMI | PshAI | Psp5II | PspCI | PspEI | PspLI | PspPPI |
| PspXI | PsrI | PsyI | RgaI | RsrII | Rsr2I | SacII |
| SanDI | SapI | SbfI | SdaI | SfaAI | SfoI | Sfr303I |
| SgfI | SgrBI | SgrDI | SgsI | SmiI | Sse8387I | SspDI |
| SstII | SwaI | Tth111I | Vha464I | XagI | XcmI |
pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo中的单酶切位点包括：
| AccI | GT'MK,AC | 1779 | MscI | TGG|CCA | 4048 |
| AhdI | GACNN,N'NNGTC | 136 | NdeI | CA`TA,TG | 1274 |
| ApaI | G,GGCC`C | 2598 | NotI | GC`GGCC,GC | 1701 |
| BamHI | G`GATC,C | 1748 | PaeR7I | C`TCGA,G | 1790 |
| BclI | T`GATC,A | 2830 | PciI | A`CATG,T | 5671 |
| BfuAI | ACCTGCNNNN`NNNN, | 4471 | PflMI | CCAN_NNN`NTGG | 1696 |
| BglII | A`GATC,T | 1784 | PspOMI | G`GGCC,C | 2594 |
| BsmBI | CGTCTCN`NNNN, | 1842 | PstI | C,TGCA`G | 1764 |
| BspDI | AT`CG,AT | 4013 | PvuII | CAG|CTG | 3671 |
| BspMI | ACCTGCNNNN`NNNN, | 4471 | SacI | G,AGCT`C | 1689 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 2583 | SalI | G`TCGA,C | 1778 |
| BssHII | G`CGCG,C | 4081 | ScaI | AGT|ACT | 616 |
| BstBI | TT`CG,AA | 4435 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 3948 |
| ClaI | AT`CG,AT | 4013 | SgrAI | CR`CCGG,YG | 4159 |
| CspCI | ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` | 1416 | SmaI | CCC|GGG | 1743 |
| EarI | CTCTTCN`NNN, | 931 | SnaBI | TAC|GTA | 1380 |
| Eco53kI | GAG|CTC | 1687 | SpeI | A`CTAG,T | 1802 |
| EcoRI | G`AATT,C | 1766 | SrfI | GCCC|GGGC | 1743 |
| EcoRV | GAT|ATC | 1774 | StuI | AGG|CCT | 3994 |
| Esp3I | CGTCTCN`NNNN, | 1842 | TspMI | C`CCGG,G | 1741 |
| FseI | GG,CCGG`CC | 4321 | XbaI | T`CTAG,A | 1796 |
| HindIII | A`AGCT,T | 1754 | XhoI | C`TCGA,G | 1790 |
| HpaI | GTT|AAC | 2936 | XmaI | C`CCGG,G | 1741 |
| MfeI | C`AATT,G | 2923 | XmnI | GAANN|NNTTC | 735 |
| MluI | A`CGCG,T | 3059 |
pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒中对插入片段进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下：
T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'
EGFP primer (1876-1892): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'
pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo的全序列信息:D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo全序列.txt。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D2811-1µg | pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo | 1µg |
| D2811-100µg | pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo | 100µg |
| － | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
