pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo
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产品编号 D2811-100μg
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1μg 100μg
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pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有HA标签(HA Tag, YPYDVPDYA)的目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和博来霉素(Zeocin)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达;可以方便地使用抗HA的抗体(AF5057/AF2305/AF0039/AH158)来检测目的蛋白;同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP,便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和博来霉素(Zeocin)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后, 可使用Zeocin (ST1450)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AmpR 63-923
AmpR promoter 924-1016
CMV enhancer 1101-1404
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter 1654-1672
HA 1712-1738
P2A 1808-1873
EGFP 1874-2593
T7 promoter 2645-2663
SV40 poly(A) signal 2937-3058
f1 ori 3065-3520
AmpR promoter 3547-3651
SV40 promoter 3653-4010
SV40 ori 3861-3996
BleoR 4045-4419
HSV TK poly(A) signal 4651-4698
ori 5027-5615

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒(5723bp)的图谱如下:

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo.pdf

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AccIII AcvI AfeI AflII AgeI
Aor13HI Aor51HI AscI AsiGI AsiSI AspI BaeI
BbeI BbrPI BbsI BbvCI BfrI BlpI BoxI
BpiI Bpu1102I BpuAI BseAI BshTI BsiWI Bsp13I
Bsp68I Bsp1720I BspEI BspQI BspTI BssNAI Bst98I
Bst1107I BstAFI BstEII BstENI BstPI BstPAI BstV2I
BstXI BstZ17I BtuMI CelII Cfr42I CpoI CspI
CspAI DinI Eco47III Eco72I Eco91I EcoNI EcoO65I
EgeI EheI FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI KasI
Kpn2I KspI LguI Mly113I MreI MroI MspCI
MssI NarI NruI PalAI PciSI Pfl23II PflFI
PI-PspI PI-SceI PinAI PluTI PmaCI PmeI PmlI
PpuMI PshAI Psp5II PspCI PspEI PspLI PspPPI
PspXI PsrI PsyI RgaI RsrII Rsr2I SacII
SanDI SapI SbfI SdaI SfaAI SfoI Sfr303I
SgfI SgrBI SgrDI SgsI SmiI Sse8387I SspDI
SstII SwaI Tth111I Vha464I XagI XcmI

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo中的单酶切位点包括:

AccI GT'MK,AC 1779 MscI TGG|CCA 4048
AhdI GACNN,N'NNGTC 136 NdeI CA`TA,TG 1274
ApaI G,GGCC`C 2598 NotI GC`GGCC,GC 1701
BamHI G`GATC,C 1748 PaeR7I C`TCGA,G 1790
BclI T`GATC,A 2830 PciI A`CATG,T 5671
BfuAI ACCTGCNNNN`NNNN, 4471 PflMI CCAN_NNN`NTGG 1696
BglII A`GATC,T 1784 PspOMI G`GGCC,C 2594
BsmBI CGTCTCN`NNNN, 1842 PstI C,TGCA`G 1764
BspDI AT`CG,AT 4013 PvuII CAG|CTG 3671
BspMI ACCTGCNNNN`NNNN, 4471 SacI G,AGCT`C 1689
BsrGI T`GTAC,A 2583 SalI G`TCGA,C 1778
BssHII G`CGCG,C 4081 ScaI AGT|ACT 616
BstBI TT`CG,AA 4435 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3948
ClaI AT`CG,AT 4013 SgrAI CR`CCGG,YG 4159
CspCI ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 1416 SmaI CCC|GGG 1743
EarI CTCTTCN`NNN, 931 SnaBI TAC|GTA 1380
Eco53kI GAG|CTC 1687 SpeI A`CTAG,T 1802
EcoRI G`AATT,C 1766 SrfI GCCC|GGGC 1743
EcoRV GAT|ATC 1774 StuI AGG|CCT 3994
Esp3I CGTCTCN`NNNN, 1842 TspMI C`CCGG,G 1741
FseI GG,CCGG`CC 4321 XbaI T`CTAG,A 1796
HindIII A`AGCT,T 1754 XhoI C`TCGA,G 1790
HpaI GTT|AAC 2936 XmaI C`CCGG,G 1741
MfeI C`AATT,G 2923 XmnI GAANN|NNTTC 735
MluI A`CGCG,T 3059

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

EGFP primer (1876-1892): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo的全序列信息:D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2811-1µg pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg
D2811-100µg pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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D2809 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Bla 1µg/100µg
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