pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo
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产品编号 D2810-100μg
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1μg 100μg
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pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有Flag标签(Flag Tag, DYKDDDDK)的目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和博来霉素(Zeocin)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达;可以方便地使用抗Flag的抗体(AF0036/AF5051/AF519)来检测目的蛋白;同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP,便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和博来霉素(Zeocin)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用Zeocin (ST1450)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AmpR 63-923
AmpR promoter 924-1016
CMV enhancer 1101-1404
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter 1654-1672
FLAG 1713-1736
P2A 1806-1871
EGFP 1872-2591
T7 promoter 2643-2661
SV40 poly(A) signal 2935-3056
f1 ori 3063-3518
AmpR promoter 3545-3649
SV40 promoter 3651-4008
SV40 ori 3859-3994
BleoR 4043-4417
HSV TK poly(A) signal 4649-4696
ori 5025-5613

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒(5721bp)的图谱如下:

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo.pdf

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AccIII AccB7I AcvI AfeI AflII
AgeI Aor13HI Aor51HI AscI AsiGI AsiSI AspI
BaeI BbeI BbrPI BbsI BbvCI BfrI BlpI
BoxI BpiI Bpu1102I BpuAI BseAI BshTI BsiWI
Bsp13I Bsp68I Bsp1720I BspEI BspQI BspTI BssNAI
Bst98I Bst1107I BstAFI BstEII BstENI BstPI BstPAI
BstV2I BstZ17I BtuMI CelII CpoI CspI CspAI
DinI Eco47III Eco72I Eco91I EcoNI EcoO65I EgeI
EheI FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI KasI Kpn2I
LguI Mly113I MreI MroI MspCI MssI NarI
NruI PalAI PciSI Pfl23II PflFI PflMI PI-PspI
PI-SceI PinAI PluTI PmaCI PmeI PmlI PpuMI
PshAI Psp5II PspCI PspEI PspLI PspPPI PspXI
PsrI PsyI RgaI RsrII Rsr2I SanDI SapI
SbfI SdaI SfaAI SfoI SgfI SgrDI SgsI
SmiI Sse8387I SspDI SwaI Tth111I Van91I Vha464I
XagI XcmI

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo中的单酶切位点包括:

AccI GT'MK,AC 1777 MluI A`CGCG,T 3057
AhdI GACNN,N'NNGTC 136 MscI TGG|CCA 4046
ApaI G,GGCC`C 2596 NdeI CA`TA,TG 1274
BamHI G`GATC,C 1746 NheI G`CTAG,C 1631
BclI T`GATC,A 2828 NotI GC`GGCC,GC 1702
BfuAI ACCTGCNNNN`NNNN, 4469 PaeR7I C`TCGA,G 1788
BglII A`GATC,T 1782 PciI A`CATG,T 5669
BmtI G,CTAG`C 1635 PspOMI G`GGCC,C 2592
BsmBI CGTCTCN`NNNN, 1840 PstI C,TGCA`G 1762
BspDI AT`CG,AT 4011 PvuII CAG|CTG 3669
BspMI ACCTGCNNNN`NNNN, 4469 SacI G,AGCT`C 1689
BsrGI T`GTAC,A 2581 SacII CC,GC`GG 1696
BssHII G`CGCG,C 4079 SalI G`TCGA,C 1776
BstBI TT`CG,AA 4433 ScaI AGT|ACT 616
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 1697 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3946
ClaI AT`CG,AT 4011 SgrAI CR`CCGG,YG 4157
CspCI ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 1416 SmaI CCC|GGG 1741
EarI CTCTTCN`NNN, 931 SnaBI TAC|GTA 1380
Eco53kI GAG|CTC 1687 SpeI A`CTAG,T 1800
EcoRI G`AATT,C 1764 SrfI GCCC|GGGC 1741
EcoRV GAT|ATC 1772 StuI AGG|CCT 3992
Esp3I CGTCTCN`NNNN, 1840 TspMI C`CCGG,G 1739
FseI GG,CCGG`CC 4319 XbaI T`CTAG,A 1794
HindIII A`AGCT,T 1752 XhoI C`TCGA,G 1788
HpaI GTT|AAC 2934 XmaI C`CCGG,G 1739
MfeI C`AATT,G 2921 XmnI GAANN|NNTTC 735

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

EGFP primer (1874-1890): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo的全序列信息:D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2810-1µg pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg
D2810-100µg pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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