pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有Flag标签(Flag Tag, DYKDDDDK)的目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和博来霉素(Zeocin)抗性基因的表达质粒。
本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达；可以方便地使用抗Flag的抗体(AF0036/AF5051/AF519)来检测目的蛋白；同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP，便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。
图1. 碧云天pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。本图仅供参考，实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。
本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率 [1,2]。
本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和博来霉素(Zeocin)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后，可使用Zeocin (ST1450)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| AmpR | 63-923 |
| AmpR promoter | 924-1016 |
| CMV enhancer | 1101-1404 |
| CMV promoter | 1405-1608 |
| T3 promoter | 1654-1672 |
| FLAG | 1713-1736 |
| P2A | 1806-1871 |
| EGFP | 1872-2591 |
| T7 promoter | 2643-2661 |
| SV40 poly(A) signal | 2935-3056 |
| f1 ori | 3063-3518 |
| AmpR promoter | 3545-3649 |
| SV40 promoter | 3651-4008 |
| SV40 ori | 3859-3994 |
| BleoR | 4043-4417 |
| HSV TK poly(A) signal | 4649-4696 |
| ori | 5025-5613 |
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒(5721bp)的图谱如下：
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo的多克隆位点的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo.pdf。
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo中没有的酶切位点包括：
| AarI | AbsI | AccIII | AccB7I | AcvI | AfeI | AflII |
| AgeI | Aor13HI | Aor51HI | AscI | AsiGI | AsiSI | AspI |
| BaeI | BbeI | BbrPI | BbsI | BbvCI | BfrI | BlpI |
| BoxI | BpiI | Bpu1102I | BpuAI | BseAI | BshTI | BsiWI |
| Bsp13I | Bsp68I | Bsp1720I | BspEI | BspQI | BspTI | BssNAI |
| Bst98I | Bst1107I | BstAFI | BstEII | BstENI | BstPI | BstPAI |
| BstV2I | BstZ17I | BtuMI | CelII | CpoI | CspI | CspAI |
| DinI | Eco47III | Eco72I | Eco91I | EcoNI | EcoO65I | EgeI |
| EheI | FspAI | I-CeuI | I-PpoI | I-SceI | KasI | Kpn2I |
| LguI | Mly113I | MreI | MroI | MspCI | MssI | NarI |
| NruI | PalAI | PciSI | Pfl23II | PflFI | PflMI | PI-PspI |
| PI-SceI | PinAI | PluTI | PmaCI | PmeI | PmlI | PpuMI |
| PshAI | Psp5II | PspCI | PspEI | PspLI | PspPPI | PspXI |
| PsrI | PsyI | RgaI | RsrII | Rsr2I | SanDI | SapI |
| SbfI | SdaI | SfaAI | SfoI | SgfI | SgrDI | SgsI |
| SmiI | Sse8387I | SspDI | SwaI | Tth111I | Van91I | Vha464I |
| XagI | XcmI |
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo中的单酶切位点包括：
| AccI | GT'MK,AC | 1777 | MluI | A`CGCG,T | 3057 |
| AhdI | GACNN,N'NNGTC | 136 | MscI | TGG|CCA | 4046 |
| ApaI | G,GGCC`C | 2596 | NdeI | CA`TA,TG | 1274 |
| BamHI | G`GATC,C | 1746 | NheI | G`CTAG,C | 1631 |
| BclI | T`GATC,A | 2828 | NotI | GC`GGCC,GC | 1702 |
| BfuAI | ACCTGCNNNN`NNNN, | 4469 | PaeR7I | C`TCGA,G | 1788 |
| BglII | A`GATC,T | 1782 | PciI | A`CATG,T | 5669 |
| BmtI | G,CTAG`C | 1635 | PspOMI | G`GGCC,C | 2592 |
| BsmBI | CGTCTCN`NNNN, | 1840 | PstI | C,TGCA`G | 1762 |
| BspDI | AT`CG,AT | 4011 | PvuII | CAG|CTG | 3669 |
| BspMI | ACCTGCNNNN`NNNN, | 4469 | SacI | G,AGCT`C | 1689 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 2581 | SacII | CC,GC`GG | 1696 |
| BssHII | G`CGCG,C | 4079 | SalI | G`TCGA,C | 1776 |
| BstBI | TT`CG,AA | 4433 | ScaI | AGT|ACT | 616 |
| BstXI | CCAN,NNNN`NTGG | 1697 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 3946 |
| ClaI | AT`CG,AT | 4011 | SgrAI | CR`CCGG,YG | 4157 |
| CspCI | ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` | 1416 | SmaI | CCC|GGG | 1741 |
| EarI | CTCTTCN`NNN, | 931 | SnaBI | TAC|GTA | 1380 |
| Eco53kI | GAG|CTC | 1687 | SpeI | A`CTAG,T | 1800 |
| EcoRI | G`AATT,C | 1764 | SrfI | GCCC|GGGC | 1741 |
| EcoRV | GAT|ATC | 1772 | StuI | AGG|CCT | 3992 |
| Esp3I | CGTCTCN`NNNN, | 1840 | TspMI | C`CCGG,G | 1739 |
| FseI | GG,CCGG`CC | 4319 | XbaI | T`CTAG,A | 1794 |
| HindIII | A`AGCT,T | 1752 | XhoI | C`TCGA,G | 1788 |
| HpaI | GTT|AAC | 2934 | XmaI | C`CCGG,G | 1739 |
| MfeI | C`AATT,G | 2921 | XmnI | GAANN|NNTTC | 735 |
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo质粒中对插入片段进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下：
T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'
EGFP primer (1874-1890): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo的全序列信息:D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo全序列.txt。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D2810-1µg | pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo | 1µg |
| D2810-100µg | pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo | 100µg |
| － | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
