pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg
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产品编号 D2797-100μg
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1μg 100μg
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pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有Myc标签(Myc Tag, EQKLISEEDL) 的目的蛋白、红色荧光蛋白mCherry和潮霉素B (Hygromycin B)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有CMV启动子可以高效启动目的基因的表达;可以方便地使用抗Myc标签的抗体(AF5054/AF0033/AM933/AM926) 来检测目的蛋白;同时可以通过P2A共表达红色荧光蛋白mCherry,便于通过mCherry的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和mCherry的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和潮霉素B (Hygromycin B)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用Hygromycin B (ST1389)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AmpR 63-923
AmpR promoter 924-1016
CMV enhancer 1101-1404
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter 1654-1672
Myc 1713-1742
P2A 1812-1877
mCherry 1878-2588
T7 promoter 2640-2658
SV40 poly(A) signal 2932-3053
f1 ori 3060-3515
AmpR promoter 3542-3646
SV40 promoter 3648-4005
SV40 ori 3856-3991
HygR 4040-5065
HSV TK poly(A) signal 5297-5344
ori 5673-6261

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒(6369bp)的图谱如下:

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2797 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg.pdf

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AcvI AfeI AflII AgeI Aor51HI
AscI AsiGI BaeI BbrPI BfrI BlpI Bpu1102I
BsePI BshTI BsiWI Bsp68I Bsp1720I BspQI BspTI
BssHII BssNAI Bst98I Bst1107I BstAFI BstENI BstZ17I
BtuMI CelII CspAI Eco47III Eco72I EcoNI FseI
FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI LguI MauBI MreI
MspCI MssI NruI PalAI PauI PciSI Pfl23II
PI-PspI PI-SceI PinAI PmaCI PmeI PmlI PpuMI
Psp5II PspCI PspLI PspPPI PspXI PsrI RigI
SanDI SapI SgrDI SgsI SmiI SwaI Vha464I
XagI

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg中的单酶切位点包括:

AccI GT`MK,AC 1783 MscI TGG|CCA 1908
ApaI G,GGCC`C 2593 NdeI CA`TA,TG 1274
AsiSI GCG,AT`CGC 4404 NheI G`CTAG,C 1631
BamHI G`GATC,C 1752 NotI GC`GGCC,GC 1702
BbsI GAAGACNN`NNNN, 2313 PaeR7I C`TCGA,G) 1794
BbvCI CC`TCA,GC 2416 PciI A`CATG,T 6317
BcgI NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` 641 PflFI GACN`N,NGTC 4544
BclI T`GATC,A 2825 PflMI CCAN,NNN`NTGG 2317
BglII A`GATC,T 1788 PshAI GACNN|NNGTC 4067
BmgBI CAC|GTC 1856 PspOMI G`GGCC,C 2589
BmtI G,CTAG`C 1635 RsrII CG`GWC,CG 4448
Bpu10I CC`TNA,GC 2416 SacI G,AGCT`C 1689
BsgI GTGCAGNNNNNNNNNNNNNN,NN` 2472 SacII CC,GC`GG 1696
BsmBI CGTCTCN`NNNN, 1846 SalI G`TCGA,C 1782
BspDI AT`CG,AT 4008 SbfI CC,TGCA`GG 2233
BsrGI T`GTAC,A 2578 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3943
BstBI TT`CG,AA 5081 SgrAI CR`CCGG,YG 2559
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 1697 SmaI CCC|GGG 1747
ClaI AT`CG,AT 4008 SnaBI TAC|GTA 1380
CspCI NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 1416 SpeI A`CTAG,T 1806
Eco53kI GAG|CTC 1687 SrfI GCCC|GGGC 1747
EcoRI G`AATT,C 1770 TspMI C`CCGG,G 1745
EcoRV GAT|ATC 1778 Tth111I GACN`N,NGTC 4544
Esp3I CGTCTCN`NNNN, 1846 XbaI T`CTAG,A 1800
HindIII A`AGCT,T 1758 XcmI CCANNNN,N`NNNNTGG 2564
HpaI GTT|AAC 2931 XhoI C`TCGA,G 1794
MfeI C`AATT,G 2918 XmaI C`CCGG,G 1745
MluI A`CGCG,T 3054 XmnI GAANN|NNTTC 735

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

mCherry primer (1880-1896): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg的全序列信息:D2797 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2797-1µg pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg
D2797-100µg pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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C0533-1.5ml Lipo8000™转染试剂 1.5ml
C0533-7.5ml Lipo8000™转染试剂 7.5ml
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D2723 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2734 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2738 pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2757 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2795 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2796 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2798 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg 1µg/100µg
D2799 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2801 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2803 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2807 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2808 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2809 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Bla 1µg/100µg
D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2812 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2813 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Zeo 1µg/100µg
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