pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有Flag标签(Flag Tag, DYKDDDDK)的目的蛋白、红色荧光蛋白mCherry和潮霉素B (Hygromycin B)抗性基因的表达质粒。
本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达；可以方便地使用抗Flag标签的抗体(AF0036/AF5051/AF519)来检测目的蛋白；同时可以通过P2A共表达红色荧光蛋白mCherry，便于通过mCherry的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。
图1. 碧云天pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。本图仅供参考，实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。
本质粒在多克隆位点和mCherry的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率 [1,2]。
本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和潮霉素B (Hygromycin B)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后，可使用Hygromycin B (ST1389)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| AmpR | 63-923 |
| AmpR promoter | 924-1016 |
| CMV enhancer | 1101-1404 |
| CMV promoter | 1405-1608 |
| T3 promoter | 1654-1672 |
| FLAG | 1713-1736 |
| P2A | 1806-1871 |
| mCherry | 1872-2582 |
| T7 promoter | 2634-2652 |
| SV40 poly(A) signal | 2926-3047 |
| f1 ori | 3054-3509 |
| AmpR promoter | 3536-3640 |
| SV40 promoter | 3642-3999 |
| SV40 ori | 3850-3985 |
| Hygromycin resistance | 4034-5059 |
| HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal | 5291-5338 |
| ori | 5667-6255 |
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒(6363bp)的图谱如下：
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg的多克隆位点的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D2795 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg.pdf。
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg中没有的酶切位点包括：
| AarI | AbsI | AcvI | AfeI | AflII | AgeI |
| Aor51HI | AscI | AsiGI | BaeI | BbrPI | BfrI |
| BlpI | Bpu1102I | BsePI | BshTI | BsiWI | Bsp68I |
| Bsp1720I | BspQI | BspTI | BssHII | BssNAI | Bst98I |
| Bst1107I | BstAFI | BstENI | BstZ17I | BtuMI | CelII |
| CspAI | Eco47III | Eco72I | EcoNI | FseI | FspAI |
| I-CeuI | I-PpoI | I-SceI | KflI | LguI | MauBI |
| MreI | MspCI | MssI | NruI | PalAI | PauI |
| PciSI | Pfl23II | PI-PspI | PI-SceI | PinAI | PmaCI |
| PmeI | PmlI | PpuMI | Psp5II | PspCI | PspLI |
| PspPPI | PspXI | PsrI | PteI | RigI | RruI |
| SanDI | SapI | SgrDI | SgsI | SmiI | SwaI |
| Vha464I | XagI |
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg中的单酶切位点包括：
| AccI | GT`MK,AC | 1777 | MscI | TGG|CCA | 1902 |
| ApaI | G,GGCC`C | 2587 | NdeI | CA`TA,TG | 1274 |
| AsiSI | GCG,AT`CGC | 4398 | NheI | G`CTAG,C | 1631 |
| BamHI | G`GATC,C | 1746 | NotI | GC`GGCC,GC | 1702 |
| BbsI | GAAGACNN`NNNN, | 2307 | PaeR7I | C`TCGA,G) | 1788 |
| BbvCI | CC`TCA,GC | 2410 | PciI | A`CATG,T | 6311 |
| BcgI | NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` | 641 | PflFI | GACN`N,NGTC | 4538 |
| BclI | T`GATC,A | 2819 | PflMI | CCAN,NNN`NTGG | 2311 |
| BglII | A`GATC,T | 1782 | PshAI | GACNN|NNGTC | 4061 |
| BmgBI | CAC|GTC | 1850 | PspOMI | G`GGCC,C | 2583 |
| BmtI | G,CTAG`C | 1635 | RsrII | CG`GWC,CG | 4442 |
| Bpu10I | CC`TNA,GC | 2410 | SacI | G,AGCT`C | 1689 |
| BsgI | GTGCAGNNNNNNNNNNNNNN,NN` | 2466 | SacII | CC,GC`GG | 1696 |
| BsmBI | CGTCTCN`NNNN, | 1840 | SalI | G`TCGA,C | 1776 |
| BspDI | AT`CG,AT | 4002 | SbfI | CC,TGCA`GG | 2227 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 2572 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 3937 |
| BstBI | TT`CG,AA | 5075 | SgrAI | CR`CCGG,YG | 2553 |
| BstXI | CCAN,NNNN`NTGG | 1697 | SmaI | CCC|GGG | 1741 |
| ClaI | AT`CG,AT | 4002 | SnaBI | TAC|GTA | 1380 |
| CspCI | NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` | 1416 | SpeI | A`CTAG,T | 1800 |
| EarI | CTCTTCN`NNN, | 931 | SrfI | GCCC|GGGC | 1741 |
| Eco53kI | GAG|CTC | 1687 | TspMI | C`CCGG,G | 1739 |
| EcoRI | G`AATT,C | 1764 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 4538 |
| EcoRV | GAT|ATC | 1772 | XbaI | T`CTAG,A | 1794 |
| Esp3I | CGTCTCN`NNNN, | 1840 | XcmI | CCANNNN,N`NNNNTGG | 2558 |
| HindIII | A`AGCT,T | 1752 | XhoI | C`TCGA,G | 1788 |
| HpaI | GTT|AAC | 2925 | XmaI | C`CCGG,G | 1739 |
| MfeI | C`AATT,G | 2912 | XmnI | GAANN|NNTTC | 735 |
| MluI | A`CGCG,T | 3048 |
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒中对插入片段进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下：
T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'
mCherry primer (1874-1890): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg的全序列信息:D2795 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg.txt。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D2795-1µg | pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg | 1µg |
| D2795-100µg | pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg | 100µg |
| － | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
