pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg
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产品编号 D2795-100μg
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1μg 100μg
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pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有Flag标签(Flag Tag, DYKDDDDK)的目的蛋白、红色荧光蛋白mCherry和潮霉素B (Hygromycin B)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达;可以方便地使用抗Flag标签的抗体(AF0036/AF5051/AF519)来检测目的蛋白;同时可以通过P2A共表达红色荧光蛋白mCherry,便于通过mCherry的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和mCherry的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和潮霉素B (Hygromycin B)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用Hygromycin B (ST1389)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AmpR 63-923
AmpR promoter 924-1016
CMV enhancer 1101-1404
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter 1654-1672
FLAG 1713-1736
P2A 1806-1871
mCherry 1872-2582
T7 promoter 2634-2652
SV40 poly(A) signal 2926-3047
f1 ori 3054-3509
AmpR promoter 3536-3640
SV40 promoter 3642-3999
SV40 ori 3850-3985
Hygromycin resistance 4034-5059
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 5291-5338
ori 5667-6255

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒(6363bp)的图谱如下:

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2795 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg.pdf

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AcvI AfeI AflII AgeI
Aor51HI AscI AsiGI BaeI BbrPI BfrI
BlpI Bpu1102I BsePI BshTI BsiWI Bsp68I
Bsp1720I BspQI BspTI BssHII BssNAI Bst98I
Bst1107I BstAFI BstENI BstZ17I BtuMI CelII
CspAI Eco47III Eco72I EcoNI FseI FspAI
I-CeuI I-PpoI I-SceI KflI LguI MauBI
MreI MspCI MssI NruI PalAI PauI
PciSI Pfl23II PI-PspI PI-SceI PinAI PmaCI
PmeI PmlI PpuMI Psp5II PspCI PspLI
PspPPI PspXI PsrI PteI RigI RruI
SanDI SapI SgrDI SgsI SmiI SwaI
Vha464I XagI

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg中的单酶切位点包括:

AccI GT`MK,AC 1777 MscI TGG|CCA 1902
ApaI G,GGCC`C 2587 NdeI CA`TA,TG 1274
AsiSI GCG,AT`CGC 4398 NheI G`CTAG,C 1631
BamHI G`GATC,C 1746 NotI GC`GGCC,GC 1702
BbsI GAAGACNN`NNNN, 2307 PaeR7I C`TCGA,G) 1788
BbvCI CC`TCA,GC 2410 PciI A`CATG,T 6311
BcgI NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` 641 PflFI GACN`N,NGTC 4538
BclI T`GATC,A 2819 PflMI CCAN,NNN`NTGG 2311
BglII A`GATC,T 1782 PshAI GACNN|NNGTC 4061
BmgBI CAC|GTC 1850 PspOMI G`GGCC,C 2583
BmtI G,CTAG`C 1635 RsrII CG`GWC,CG 4442
Bpu10I CC`TNA,GC 2410 SacI G,AGCT`C 1689
BsgI GTGCAGNNNNNNNNNNNNNN,NN` 2466 SacII CC,GC`GG 1696
BsmBI CGTCTCN`NNNN, 1840 SalI G`TCGA,C 1776
BspDI AT`CG,AT 4002 SbfI CC,TGCA`GG 2227
BsrGI T`GTAC,A 2572 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3937
BstBI TT`CG,AA 5075 SgrAI CR`CCGG,YG 2553
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 1697 SmaI CCC|GGG 1741
ClaI AT`CG,AT 4002 SnaBI TAC|GTA 1380
CspCI NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 1416 SpeI A`CTAG,T 1800
EarI CTCTTCN`NNN, 931 SrfI GCCC|GGGC 1741
Eco53kI GAG|CTC 1687 TspMI C`CCGG,G 1739
EcoRI G`AATT,C 1764 Tth111I GACN`N,NGTC 4538
EcoRV GAT|ATC 1772 XbaI T`CTAG,A 1794
Esp3I CGTCTCN`NNNN, 1840 XcmI CCANNNN,N`NNNNTGG 2558
HindIII A`AGCT,T 1752 XhoI C`TCGA,G 1788
HpaI GTT|AAC 2925 XmaI C`CCGG,G 1739
MfeI C`AATT,G 2912 XmnI GAANN|NNTTC 735
MluI A`CGCG,T 3048

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

mCherry primer (1874-1890): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg的全序列信息:D2795 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg.txt

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产品编号 产品名称 包装
D2795-1µg pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg
D2795-100µg pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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D2809 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Bla 1µg/100µg
D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
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