pCMV-N-Flag-Hyg
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产品编号 D2777-1μg
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¥ 888.00
产品包装:
1μg 100μg
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pCMV-N-Flag-Hyg是碧云天自行研发的用于在哺乳动物细胞中表达N端带有Flag标签(Flag Tag,DYKDDDDK)的目的蛋白的表达质粒。质粒含有CMV启动子可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达;在多克隆位点的5′端含有一个编码Flag标签的序列,可以表达含有Flag标签的融合蛋白,因此可以方便地使用抗Flag的抗体来识别目的蛋白,从而有利于目的蛋白检测和分离纯化。

pCMV-N-Flag-Hyg质粒为氨苄青霉素抗性和潮霉素B (Hygromycin B)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌,而在转染哺乳动物细胞后,可利用其Hygromycin B抗性筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。Hygromycin B (ST1389)可以从碧云天购买。

Hygromycin B是来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的一种氨基糖苷类抗生素,可通过中断易位并增加80S核糖体上的错误翻译而抑制蛋白质的合成,从而杀死原核或真核细胞。大肠杆菌来源的Hygromycin B抗性基因(hyghph)所编码的Hygromycin B磷酸转移酶可将Hygromycin B磷酸化,导致其失活,从而使细胞对Hygromycin B产生抗性。因此,Hygromycin B可用于筛选成功转染Hygromycin B抗性基因的原核或真核细胞。

Hygromycin B用于细胞筛选的浓度范围是100~1000μg/ml,实际应用时应针对不同的细胞系测试Hygromycin B的浓度梯度,确定最佳使用浓度。

pCMV-N-Flag-Hyg质粒(5586bp)的图谱如下:

pCMV-N-Flag-Hyg质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
Ampicillin resistance ORF 63-923
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter and T3 primer binding site 1654-1672
Flag tag 1713-1736
Multiple cloning site (XmaI-ApaI) 1739-1811
T7 promoter and T7 primer binding site 1857-1875
SV40 polyA signal 2149-2270
f1 origin of ss-DNA replication 2277-2732
SV40 promoter 2865-3222
Hygromycin resistance ORF 3257-4282
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 4514-4561
pUC origin 4890-5478

pCMV-N-Flag-Hyg的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2777 pCMV-N-Flag-Hyg.pdf

pCMV-N-Flag-Hyg中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-N-Flag-Hyg)包括:

Afe I Afl II Age I Asc I Bae I BbsI
BbvC I Blp I BmgB I Bpu10 I Bsg I BsiW I
BsmB I BspQ I BsrG I BssH II BstE II BstZ17 I
EcoN I Esp3 I Fse I Kas I Msc I Nar I
Nru I PflM I PluT I Pme I Pml I PpuM I
PspX I Sap I Sbf I Sfo I SgrA I Swa I
Xcm I

pCMV-N-Flag-Hyg中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-N-Flag-Hyg once)包括:

AccI GT`MK,AC 1777 NheI G`CTAG,C 1631
AleI CACNN|NNGTG 1695 NotI GC`GGCC,GC 1702
ApaI G,GGCC`C 1806 PaeR7I C`TCGA,G 1788
AsiSI GCG,AT`CGC 3619 PciI A`CATG,T 5534
BamHI G`GATC,C 1746 PflFI GACN`N,NGTC 3761
BcgI NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` 639 PshAI GACNN|NNGTC 3284
BclI T`GATC,A 2042 PspOMI G`GGCC,C 1806
BglII A`GATC,T 1782 PstI C,TGCA`G 1758
BmtI G,CTAG`C 1631 PvuII CAG|CTG 2883
BsaXI NNN`(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN` 2432 RsrII CG`GWC,CG 3665
BseRI GAGGAG(N)8,NN` 3201 SacI G,AGCT`C 1685
BspDI AT`CG,AT 3225 SacII CC,GC`GG 1694
BstBI TT`CG,AA 4298 SalI G`TCGA,C 1776
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 1693 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3157
ClaI AT`CG,AT 3225 SmaI CCC|GGG 1741
CspCI NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 1414 SnaBI TAC|GTA 1380
EarI CTCTTCN`NNN, 931 SpeI A`CTAG,T 1800
Eco53kI GAG|CTC 1687 SrfI GCCC|GGGC 1741
EcoRI G`AATT,C 1764 StuI AGG|CCT 3206
EcoRV GAT|ATC 1772 TspMI C`CCGG,G 1739
HindIII A`AGCT,T 1752 Tth111I GACN`N,NGTC 3761
HpaI GTT|AAC 2148 XbaI T`CTAG,A 1794
MfeI C`AATT,G 2135 XhoI C`TCGA,G 1788
MluI A`CGCG,T 2271 XmaI C`CCGG,G 1739
NdeI CA`TA,TG 1274 XmnI GAANN|NNTTC 735

pCMV-N-Flag-Hyg质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5’ AATTAACCCTCACTAAAGG 3’

T7 primer (1857-1875): 5’ TAATACGACTCACTATAGG 3’

pCMV-N-Flag-Hyg的全序列信息:D2777 pCMV-N-Flag-Hyg-seq.txt

不同真核表达质粒的比较和选择,以及标签和抗性的考虑可以参考如下网页:

https://www.beyotime.com/goods.do?method=lcode&lcode=001001001004

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2777-1μg pCMV-N-Flag-Hyg 1μg
D2777-100μg pCMV-N-Flag-Hyg 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1μg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100μg包装的本产品质粒浓度为0.1μg/μl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-N-Flag-Hyg质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
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