pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo
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产品编号 D2757-1μg
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pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有Myc标签(Myc tag, EQKLISEEDL)的目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和新霉素(Neomycin)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有CMV启动子可以高效启动目的基因的表达;可以方便地使用抗Myc标签的抗体(AF5054/AF0033/AM933/AM926)来检测目的蛋白;同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP,便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为卡那霉素(Kanamycin)和新霉素(Neomycin)抗性。可利用其卡那霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用G-418 (ST081/ST082)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV enhancer 67-370
CMV promoter 371-574
T3 promoter 620-638
Myc 679-708
P2A 778-843
EGFP 844-1563
T7 promoter 1615-1633
SV40 poly(A) signal 1907-2028
f1 ori 2035-2490
AmpR promoter 2517-2621
SV40 promoter 2623-2980
SV40 ori 2831-2966
NeoR/KanR 3015-3809
HSV TK poly(A) signal 4041-4088
ori 4417-5005

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒(5113bp)的图谱如下:

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo的多克隆位点的详细图谱如下:https://www.beyotime.com/Manual/D2757 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo.pdf

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AccIII Acc113I AccB7I AclI AcvI
AfeI AflII AgeI AhdI Aor13HI Aor51HI AscI
AsiGI AsiSI Asp700I AspEI BaeI BbrPI BbsI
BbvCI BfrI BlpI BmcAI BmeRI BoxI BpiI
Bpu1102I BpuAI BseAI BsePI BshTI BsiWI Bsp13I
Bsp68I Bsp1720I BspEI BspQI BspTI BssHII BssNAI
Bst98I Bst1107I BstAFI BstEII BstENI BstPI BstPAI
BstV2I BstZ17I BtuMI CelII CspAI DriI Eam1105I
Eco47III Eco72I Eco91I EcoNI EcoO65I FseI FspAI
I-CeuI I-PpoI I-SceI Kpn2I LguI MauBI MreI
MroI MroXI MspCI MssI NruI PalAI PauI
PciSI PdmI Pfl23II PflMI PI-PspI PI-SceI PinAI
PmaCI PmeI PmlI PpuMI PshAI Psp5II Psp1406I
PspCI PspEI PspLI PspPPI PspXI PsrI RgaI
RigI SanDI SapI SbfI ScaI SdaI SfaAI
SgfI SgrAI SgrDI SgsI SmiI Sse8387I SwaI
Van91I Vha464I XagI XcmI XmnI ZrmI

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo中的单酶切位点包括:

AccI GT`MK,AC 749 MluI A`CGCG,T 2029
ApaI G,GGCC`C 1568 MscI TGG|CCA 3225
ApaLI G`TGCA,C 4747 NarI GG`CG,CC 3143
BamHI G`GATC,C 718 NdeI CA`TA,TG 240
BcgI ,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` 934 NheI G`CTAG,C 597
BclI T`GATC,A 1800 NotI GC`GGCC,GC 668
BglII A`GATC,T 754 PaeR7I C`TCGA,G 760
BmgBI CAC|GTC 822 PciI A`CATG,T 5061
BmtI G,CTAG`C 601 PflFI GACN`N,NGTC 3261
BsaI GGTCTCN`NNNN, 4132 PluTI G,GCGC`C 3146
BsaXI ,NNN`(N)9ACNNNNNCTCC(N)7,NNN` 2193 PspOMI G`GGCC,C 1564
BsmBI CGTCTCN`NNNN, 812 PstI C,TGCA`G 734
BspDI AT`CG,AT 2983 PvuI CG,AT`CG 1646
BsrDI GCAATG,NN` 3376 RsrII CG`GWC,CG 3659
BsrGI T`GTAC,A 1553 SacI G,AGCT`C 655
BstBI TT`CG,AA 3825 SacII CC,GC`GG 662
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 663 SalI G`TCGA,C 748
ClaI AT`CG,AT 2983 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 2918
CspCI ,NN`(N)11CAANNNNNGTGG(N)10,NN` 382 SfoI GGC|GCC 3144
DraIII CAC,NNN`GTG 2259 SmaI CCC|GGG 713
DarI CTCTTCN`NNN, 692 SnaBI TAC|GTA 346
Eco53kI GAG|CTC 653 SpeI A`CTAG,T 772
EcoRI G`AATT,C 736 SrfI GCCC|GGGC 713
EcoRV GAT|ATC 744 StuI AGG|CCT 2964
Esp3I CGTCTCN`NNNN, 812 TspMI C`CCGG,G 711
HindIII A`AGCT,T 724 Tth111I GACN`N,NGTC 3261
HpaI GTT|AAC 1906 XbaI T`CTAG,A 766
KasI G`GCGC,C 3142 XhoI C`TCGA,G 760
MfeI C`AATT,G 1893 XmaI C`CCGG,G 711

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒中对于插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物EGFP primer的序列如下:

T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'

EGFP primer (846-862): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo的全序列信息:D2757 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo 全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2757-1µg pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg
D2757-100µg pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo 100µg
说明书 1份
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-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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产品编号 产品名称 包装
ST081 G-418 1g
ST082 G-418 5g
C0533-0.5ml Lipo8000™转染试剂 0.5ml
C0533-1.5ml Lipo8000™转染试剂 1.5ml
C0533-7.5ml Lipo8000™转染试剂 7.5ml
D2633 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo 1µg/100µg
D2640 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo 1µg/100µg
D2673 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Neo 1µg/100µg
D2723 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2734 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2738 pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2795 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2796 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2797 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2798 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg 1µg/100µg
D2799 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2801 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2803 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2807 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2808 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2809 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Bla 1µg/100µg
D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2812 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2813 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Zeo 1µg/100µg
D2814 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla 1µg/100µg
D2819 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla 1µg/100µg
D2822 pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Hyg 1µg/100µg
D2823 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Myc-Hyg 1µg/100µg
D2824 pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur 1µg/100µg
D2825 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Myc-Pur 1µg/100µg
D2826 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Pur 1µg/100µg
D2827 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2828 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Zeo 1µg/100µg
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