pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo
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产品编号 D2738-100μg
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pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有His标签(His tag, HHHHHH)的目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和新霉素(Neomycin)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达;可以方便地使用抗His标签的抗体(AF5060/AH367)来检测目的蛋白;同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP,便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为卡那霉素(Kanamycin)和新霉素(Neomycin)抗性。可利用其卡那霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用G-418 (ST081/ST082)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV enhancer 67-370
CMV promoter 371-574
T3 promoter 620-638
6xHis 679-696
P2A 766-831
EGFP 832-1551
T7 promoter 1603-1621
SV40 poly(A) signal 1895-2016
f1 ori 2023-2478
AmpR promoter 2505-2609
SV40 promoter 2611-2968
SV40 ori 2819-2954
NeoR/KanR 3003-3797
HSV TK poly(A) signal 4029-4076
ori 4405-4993

pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒(5101bp)的图谱如下:

pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo的多克隆位点的详细图谱如下:https://www.beyotime.com/Manual/D2738 pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo.pdf

pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AccIII Acc113I AccB7I AclI AcvI
AfeI AflII AgeI AhdI Aor13HI Aor51HI AscI
AsiGI AsiSI Asp700I AspEI BaeI BbrPI BbsI
BbvCI BfrI BlpI BmcAI BmeRI BoxI BpiI
Bpu1102I BpuAI BseAI BsePI BshTI BsiWI Bsp13I
Bsp68I Bsp1720I spEI BspQI BspTI BssHII BssNAI
Bst6I Bst98I Bst1107I BstAFI BstEII BstENI BstPI
BstPAI BstV2I BstZ17I BtuMI CelII CspAI DriI
Eam1104I Eam1105I EarI Eco47III Eco72I Eco91I EcoNI
EcoO65I FseI FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI Kpn2I
Ksp632I LguI MauBI MreI MroI MroXI MspCI
MssI NruI PalAI PauI PciSI PdmI Pfl23II
PflMI PI-PspI PI-SceI PinAI PmaCI PmeI PmlI
PpuMI PshAI Psp5II Psp1406I PspCI PspEI PspLI
PspPPI PspXI PsrI RgaI RigI SanDI SapI
SbfI ScaI SdaI SfaAI SgfI SgrAI SgrDI
SgsI SmiI Sse8387I SwaI Van91I Vha464I XagI
XcmI XmnI ZrmI

pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo中的单酶切位点包括:

AccI GT`MK,AC 737 MscI TGG|CCA 3213
ApaI G,GGCC`C 1556 NarI GG`CG,CC 3131
ApaLI G`TGCA,C 4735 NdeI CA`TA,TG 240
BamHI G`GATC,C 706 NheI G`CTAG,C 597
BcgI ,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` 922 NotI GC`GGCC,GC 668
BclI T`GATC,A 1788 PaeR7I C`TCGA,G 748
BglII A`GATC,T 742 PciI A`CATG,T 5049
BmgBI CAC|GTC 810 PflFI GACN`N,NGTC 3249
BmtI G,CTAG`C 601 PluTI G,GCGC`C 3134
BsaI GGTCTCN`NNNN, 4120 PspOMI G`GGCC,C 1552
BsaXI ,NNN`(N)9ACNNNNNCTCC(N)7,NNN` 2181 PstI C,TGCA`G 722
BsmBI CGTCTCN`NNNN, 800 PvuI CG,AT`CG 1634
BspDI AT`CG,AT 2971 RsrII CG`GWC,CG 3647
BsrDI GCAATG,NN` 3364 SacI G,AGCT`C 655
BsrGI T`GTAC,A 1541 SacII CC,GC`GG 662
BstBI TT`CG,AA 3813 SalI G`TCGA,C 736
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 663 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 2906
ClaI AT`CG,AT 2971 SfoI GGC|GCC 3132
CspCI ,NN`(N)11CAANNNNNGTGG(N)10,NN` 382 SmaI CCC|GGG 701
DraIII CAC,NNN`GTG 2247 SnaBI TAC|GTA 346
Eco53kI GAG|CTC 653 SpeI A`CTAG,T 760
EcoRI G`AATT,C 724 SrfI GCCC|GGGC 701
EcoRV GAT|ATC 732 StuI AGG|CCT 2952
Esp3I CGTCTCN`NNNN, 800 TspMI C`CCGG,G 699
HindIII A`AGCT,T 712 Tth111I GACN`N,NGTC 3249
HpaI GTT|AAC 1894 XbaI T`CTAG,A 754
KasI G`GCGC,C 3130 XhoI C`TCGA,G 748
MfeI C`AATT,G 1881 XmaI C`CCGG,G 699
MluI A`CGCG,T 2017

pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒中对于插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物EGFP primer的序列如下:

T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'

EGFP primer (834-850): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo的全序列信息:D2738 pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo 全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2738-1µg pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg
D2738-100µg pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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产品编号 产品名称 包装
ST081 G-418 1g
ST082 G-418 5g
C0533-0.5ml Lipo8000™转染试剂 0.5ml
C0533-1.5ml Lipo8000™转染试剂 1.5ml
C0533-7.5ml Lipo8000™转染试剂 7.5ml
D2633 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo 1µg/100µg
D2640 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo 1µg/100µg
D2673 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Neo 1µg/100µg
D2723 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2734 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2757 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2795 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2796 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2797 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2798 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg 1µg/100µg
D2799 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2801 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2803 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2807 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2808 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2809 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Bla 1µg/100µg
D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2812 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2813 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Zeo 1µg/100µg
D2814 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla 1µg/100µg
D2819 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla 1µg/100µg
D2822 pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Hyg 1µg/100µg
D2823 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Myc-Hyg 1µg/100µg
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