pGL6-TA-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒)
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产品编号 D2094-100μg
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pGL6-TA-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒)是碧云天自行研发的用于在哺乳动物细胞中进行萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)报告基因检测的新一代质粒。本质粒的主要特点是使用了可以被细胞内泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)识别并快速降解的luciferase-CP (luc-CP),即包含了泛素化修饰识别序列CP (CL1 and PEST)的luciferase,确保了更低的背景表达和更好的响应性。pGL6-TA-CP主要用于在其多克隆位点插入特定的启动子、增强子等调控元件研究该调控序列的基因转录调控活性。

pGL6-TA-CP质粒是用于在哺乳动物细胞中进行萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)报告基因检测的新一代质粒,该报告基因质粒和Promega公司的pGL3系列相比有了全面的改进。一方面对于luciferase的编码进行了改进,确保能更好地在哺乳动物细胞中进行表达;另一方面应用了快速降解型报告基因技术,在luciferase后增加了泛素-蛋白酶体系统识别和降解序列CL1和PEST,合并简称CP,从而可以促进luciferase-CP在细胞中的降解,降低萤光素酶的本底活性。同时整个质粒中可以被预测出的可能的转录因子结合位点全部进行了适当的突变处理,在保持原有功能不变的情况下,使各种转录因子在质粒上的非特异性结合降到最低。与pGL6-CP (D2093)相比,pGL6-TA-CP在多克隆位点和luc基因之间加入了一段minimal TA promoter,使luciferase基因的基础转录水平提高。

本质粒中的CP包含针对哺乳动物细胞密码子优化的降解序列hCL1和hPEST。CL1源自酿酒酵母的16个氨基酸序列,可以引导蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system)降解[1];PEST源自小鼠鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase) C端的40个氨基酸序列(富含脯氨酸/proline (P)、谷氨酸/glutamic acid (E)、丝氨酸/serine (S)和苏氨酸/threonine (T),PEST),该序列可通过泛素-蛋白酶体系统促进蛋白质的降解[2]。与普通报告基因相比,快速降解型报告基因的背景更低,响应性更好,检测灵敏度更高,更适合监测动态变化过程,例如转录活性的节律变化等。

萤光素、萤光素酶、萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶也经常被称作荧光素、荧光素酶、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。

pGL6-TA-CP质粒的图谱如下:

pGL6-TA-CP质粒的主要信息如下:

Base pairs 5815
Multiple cloning region 1-59
Minimal TA promoter (pTA) 66-97
Luciferase reporter gene 130-1780
hCL1 1786-1833
hPEST 1837-1956
SV40 late poly(A) signal 2012-2133
SV40 early enhancer/promoter 2327-2684
Synthetic neomycin phosphotransferase (Neor) coding region 2715-3509
Synthetic poly(A) signal 3534-3582
Reporter Vector primer 4 (RVprimer4) binding region 3649-3668
ColE1-derived plasmid replication origin 3906
Ampicillin 4691-5557
Synthetic poly(A) signal/transcriptional pause site 5662-5815
Reporter Vector primer 3 (RVprimer3) binding region 5764-5783

pGL6-TA-CP的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2094 pGL6-TA-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒).pdf

pGL6-TA-CP中没有的酶切位点包括:

Aat II Asc I Ase I Bsa I BsaA I BsiW I BspM II
BssH II Eco72 I EcoR I EcoR V Nde I Nru I PflM I
Pme I Pml I Psp1406 I PspA I Rsr II Sma I SnaB I
Spl I Srf I Tth111 I

pGL6-TA-CP中的单酶切位点包括:

Sfi I GGCCN,NNN`NGGCC 8 BamH I G`GATC,C 2235
Bgl I GCCN,NNN`NGGC 8 Stu I AGG|CCT 2668
Acc65 I G`GTAC,C 14 EcoN I CCTNN`N,NNAGG 3189
Asp718 G`GTAC,C 14 BstB I TT`CG,AA 3584
Kpn I G,GTAC`C 18 Sal I G`TCGA,C 3598
Nhe I G`CTAG,C 20 ApaL I G`TGCA,C 4162
PaeR7 I C`TCGA,G 26 Not I GC`GGCC,GC 4668
Xho I C`TCGA,G 26 BstX I CCAN,NNNN`NTGG 4692
Sac I G,AGCT`C 36 BstE II G`GTNAC,C 4695
Mlu I A`CGCG,T 38 Ahd I GACNN,N`NNGTC 4770
Bgl II A`GATC,T 44 Bsu36 I CC`TNA,GG 5126
Hind III A`AGCT,T 54 Pvu I CG,AT`CG 5140
BsrG I T`GTAC,A 620 Sac II CC,GC`GG 5164
Gsu I CTGGAG 21/19 1510 Bst1107 I GTA|TAC 5280
Bpm I CTGGAG 22/20 1510 Spe I A`CTAG,T 5599
Afl II A`CRYG,T 1809 BsmA I GTCTC`/9 5612
Mun I C`AATT,G 2142 BsmB I CGTCTC 7/11 5612

pGL6-TA-CP质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

RVprimer3 (5764-5783): CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC

pGL6-TA-CP的全序列信息:D2094 pGL6-TA-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒)-序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2094-1μg pGL6-TA-CP 1μg
D2094-100μg pGL6-TA-CP 100μg
说明书 1份
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-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.用于插入调控序列:在多克隆位点选取适当的酶切位点,经酶切处理后连入适当的基因转录调控序列。pGL6-TA-CP也可以用作报告基因检测时的阴性对照。
4.pGL6-TA-CP质粒以及以此质粒为模板构建的质粒可以用常规的细胞转染方法转染细胞。检测时可以采用碧云天的萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG005/RG006)双萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG027/RG028)
参考文献:
1.Gilon T, Chomsky O, Kulka R.G. EMBO J. 1998. 17:2759-66.
2.Rogers S, Wells R, Rechsteiner M. Science. 1986. 234 (4774):364-8.
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