碧云天生产的毕赤酵母X-33甘油菌(Pichia Pastoris X-33 Yeast Glycerol Stock) 是取对数生长期的毕赤酵母X-33菌液，加入等体积30% (v/v)甘油制备而成。本甘油菌可以直接平板划线或小量、大量培养。

毕赤酵母具有真核细胞表达系统多方面的优势，包括较好的蛋白翻译后剪切、蛋白折叠以及翻译后修饰等[1]。与昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统相比，毕赤酵母表达系统快速、高效且经济，通常外源蛋白还具有较高的表达水平。与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相比，毕赤酵母的外源蛋白表达水平往往高10-100倍，并且能进行分泌蛋白的N-连接糖苷键修饰。但表达分泌蛋白进行糖基化修饰时的糖链长度是有差别的，毕赤酵母修饰的分泌蛋白的糖链长度通常是8-14个甘露糖残基(Mannose residue)，而酿酒酵母修饰的分泌蛋白的糖链长度通常是50-150个甘露糖残基，此外，毕赤酵母很少对分泌蛋白进行O-连接糖苷键的修饰[2]。

毕赤酵母表达系统中高水平重组蛋白表达的宿主是甲基营养型(即甲醇利用正常型)毕赤酵母(Methylotrophic yeast Pichia pastoris)。在没有葡萄糖的情况下，毕赤酵母使用甲醇作为碳源。乙醇氧化酶(Alcohol oxidase, AOX1)启动子控制乙醇氧化酶的表达，是催化甲醇代谢的第一步。通常，甲醇诱导的细胞中总可溶性蛋白质的30%是乙醇氧化酶[3]。一些毕赤酵母表达载体利用强大的AOX1启动子，并使用甲醇诱导目的基因的高水平表达。如果更倾向于不依赖于甲醇诱导的表达，可以使用GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因的启动子实现组成型表达。诱导型和组成型表达构建物均整合到毕赤酵母基因组中，形成稳定的宿主，产生极高的蛋白质表达水平。AOX1基因突变丧失功能时，乙醇氧化酶活性缺失，产生Methanol utilization slow (Mut^s)基因型，也称Methanol utilization minus (Mut^-)基因型，而AOX1基因表达正常则被称为Methanol utilization plus (Mut⁺)基因型[4]。毕赤酵母X-33为Mut⁺基因型。

毕赤酵母X-33属于野生型菌株，含有AOX1基因，产生的转化株是Mut⁺ (Methanol utilization plus)基因型。X-33毕赤酵母被推荐用来表达含有Zeocin抗性的载体重组质粒，在筛选X-33重组转化菌株时，Zeocin抗生素的工作浓度推荐是100μg/ml。

毕赤酵母X-33基因型：Wild type。

本甘油菌适宜的生长温度是28-30℃，温度超过32℃不利于蛋白的表达，并可能导致细胞的死亡。

本甘油菌可以在复合培养基YPD中生长。

关于碧云天不同甘油菌菌种的比较和选择，可参考碧云天的相关网页：http://www.beyotime.com/support/strain.htm

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D0414	毕赤酵母X-33甘油菌	200μl
—	说明书	1份

保存条件：

-80℃保存，至少2年有效。须注意避免反复冻融。

注意事项：

使用本甘油菌时可以不必完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加酵母菌的活力会逐渐下降。在没有结冻的情况下，菌体会逐渐沉淀至管底，请务必注意适当混匀后使用。

为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板然后再挑单克隆菌落进行后续操作。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.划平板接种：
取出甘油菌置于冰上，并置于超净台内，后续操作都在超净台内操作。
a.用镊子和塑料枪头操作：镊子的顶端在70%酒精中蘸一下，并且在酒精灯上略略烧一下，使镊子的顶端处于无菌状态。用镊子夹取一个无菌的200µl塑料枪头，蘸取少量甘油菌，然后把蘸有菌液的塑料枪头，以尽量和YPD平板接近平行的角度，连续作S形或Z形划动，再用一个无菌的200µl塑料枪头，在原先的划线上以90º或120º角，再在YPD平板上连续作S形或Z形划动。通常换枪头重复操作2-3次即可。30℃倒置培养2-4天。
b.用接种环操作：将接种环在酒精灯上略略烧一下，使接种环处于无菌状态。微冷后，蘸取少量甘油菌，在YPD平板上连续作S形或Z形划动。把接种环再烧一下，微冷后，在原先的划线上以90º或120º角，再在YPD平板上连续作S形或Z形划动。通常用接种环重复操作2-3次即可。30℃倒置培养2-4天。
2.直接培养：
取出甘油菌置于冰上，并置于超净台内，后续操作都在超净台内操作。把镊子的顶端在70%酒精中蘸一下，并且在酒精灯上略略烧一下，使镊子的顶端处于无菌状态。用镊子夹取一个无菌的塑料枪头或牙签，蘸取甘油菌，然后把蘸有菌液的塑料枪头或牙签放到装有3ml YPD培养基内或装有100ml或更大体积YPD培养基内。28-30℃摇床过夜培养。
参考文献：
1.LiuY, SuC, Hu YH, Ouyang KQ, Cai SX. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2005. 21(3):430-4.
2.Grinna LS, Tschopp JF. Yeast. 1989. 5(2):107-15.
3.Kielkopf CL, Bauer W, Urbatsch IL. Cold Spring Harb Protoc. 2021. 2021(1).
4.Orman MA, Calik P, Ozdamar TH. Biotechnol Appl Biochem. 2009. 52(Pt 3):245-55.
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产品编号	产品名称	包装
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