碧云天生产的QuickMutation™基因定点突变试剂盒(QuickMutation™ Site-Directed Mutagenesis Kit)可以快速完成质粒DNA的点突变(point mutation),多个邻近密码子的突变,单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)突变。
基因定点突变常用于研究基因的转录调控、RNA或蛋白质的结构和功能,以及用于质粒中部分序列的微调等。
本试剂盒利用了目前最常用的基因点突变技术,只需通过基于PCR的突变质粒的生成,和基于DpnI的模板质粒的消化,转化培养以及后续的酶切或测序鉴定,即可得到预期的突变质粒 (参考图1)。DpnI消化仅需5分钟,累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。
图1.基因定点突变试剂盒原理图
本试剂盒使用了最新的保真性更强,灵敏度更高,扩增速度可达2kb/min,扩增长度可达12kb的BeyoFusion™ DNA Polymerase,从而大大缩短了突变反应所需的时间,进一步提高了基因定点突变的成功率。同时进一步严格验证了试剂盒中的DpnI,确保能在5分钟内充分消化掉甲基化的模板质粒,同时不会消化未甲基化的PCR产物。
参考图1,使用本试剂盒时需要先设计长度通常为25-45个碱基互补的两个引物,在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板,用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒,但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于DH5α等dam+大肠杆菌,在这些dam+细菌中质粒会被甲基化修饰,而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理,可以消化掉待突变的质粒模板,而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后,突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复,得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
本试剂盒提供了DH5α甘油菌,可用于感受态细菌的制备。
本试剂盒分别使用6kb和12kb的质粒进行了点突变测试,实测突变率接近100%(参考图2)。实际进行点突变时,可能会因为突变引物的设计、模板使用量、感受态效率等因素出现不同的突变率。
图2. 本试剂盒实际使用效果图。A. 使用本试剂盒进行点突变获得的LB平板照片。以一个6kb质粒为模板,使用本试剂盒进行PCR扩增以实现点突变,DpnI 37℃消化5min,取10μl产物转化100μl DH5α感受态,涂板后37℃培养过夜所获得的LB平板照片。B. 阴性对照LB平板照片。与A相比没有添加BeyoFusion™ DNA Polymerase,这样模板质粒完全被DpnI酶所消化,没有任何的假阳性克隆产生。C. 突变前后的测序图。突变前的测序结果(WT, wild type)和从图A中挑取9个克隆的测序结果(Mu,mutant)。箭头所示为拟突变的位点,红色下划线的为突变前和突变后的碱基。本次实验的突变率达到了100%。
本试剂盒小包装D0206S和中包装D0206M分别可以进行十次和五十次基因定点突变反应。
包装清单:产品编号 | 产品名称 | 包装 |
D0206S-1 | BeyoFusion™ DNA Polymerase | 10μl |
D0206S-2 | 10X BeyoFusion™ Buffer (with Mg2+) | 100μl |
D0206S-3 | dNTP Mix (2.5mM each) | 100μl |
D0206S-4 | DpnI | 10μl |
D0206S-5 | DH5α甘油菌 | 200μl |
D0206S-6 | Nuclease-Free Water | 1ml |
— | 说明书 | 1份 |
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
D0206M-1 | BeyoFusion™ DNA Polymerase | 50μl |
D0206M-2 | 10X BeyoFusion™ Buffer (with Mg2+) | 500μl |
D0206M-3 | dNTP Mix (2.5mM each) | 500μl |
D0206M-4 | DpnI | 50μl |
D0206M-5 | DH5α甘油菌 | 1ml |
D0206M-6 | Nuclease-Free Water | 5ml |
— | 说明书 | 1份 |
-20℃保存,一年有效。
注意事项:需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。
需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。
使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
扩增片段小于6kb | 扩增片段大于6kb | |||
试剂 | 最终浓度 | 体积 | 最终浓度 | 体积 |
Nuclease-Free Water | - | ?μl | - | ?μl |
10X BeyoFusion™ Buffer (with Mg2+) | 1X | 5μl | 1X | 5μl |
引物混合物(10μM each) | 0.4μM each | 2μl | 0.8μM each | 4μl |
dNTP mix (2.5mM each) | 0.25mM each | 5μl | 0.5mM each | 10μl |
待突变模板质粒 | 200ng | ?μl | 200ng | ?μl |
BeyoFusion™ DNA Polymerase | 1/50 | 1μl | 1/50 | ?1μl |
总体积 | - | 50μl | - | 50μl |
步骤 | 循环数 | 温度 | <6kb时的时间 | >6kb时的时间 | 说明 |
1 | 1 | 95℃ | 3min | 3min | 最初变性 |
2 | 20 | 95℃ | 30sec | 30sec | 变性 |
55℃ | 30sec | 30sec | 退火 | ||
68℃ | 30sec/kb | 60sec/kb | 延伸 | ||
3 | 1 | 68℃ | 10min | 15min | 延伸、补全 |
4 | 1 | 4℃ | 长时间保持 | 长时间保持 | 暂时存放 |