Lenti-CRE-TA-Luc-EF1α-Puro (10^8TU/ml, 报告基因慢病毒)是碧云天自行研发的一种可以在大多数哺乳动物细胞(包括原代细胞和干细胞)中表达CRE (cAMP Response Element)报告基因并组成性表达嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的重组慢病毒。本产品可用于高灵敏度地检测CREB的激活水平。本产品带有嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因，感染细胞后可以使用嘌呤霉素筛选稳定株。

CREB (cAMP Response Element Binding Protein)即环磷腺苷效应元件结合蛋白，是一种通过结合CRE (cAMP Response Element)序列调节细胞增殖、节律和记忆形成等多种生物功能的转录因子[1, 2]。

EF1α (EF1a)启动子是一种来源于延伸因子1α (Elongation factor 1 alpha, EF1α)基因的强哺乳动物表达启动子，可在多种细胞中稳定驱动其下游基因的组成型表达，也可以用于干细胞、原代细胞、造血细胞等。

萤光素、萤光素酶、萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶也经常被称作荧光素、荧光素酶、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出波长为560nm左右的生物萤光(Bioluminescence) [3]。生物萤光可以通过化学发光仪(Luminometer)或液闪测定仪进行测定。通过萤光素和萤光素酶这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。本病毒中的萤火虫萤光素酶编码进行了改进，确保能更好地在哺乳动物细胞中进行表达。

慢病毒感染细胞后会将目的基因随机整合到基因组DNA上，因而可以长期稳定地表达目的蛋白，并且几乎可以感染所有哺乳动物细胞，在很多不分裂的细胞中也可以长期稳定表达，广泛应用于细胞和动物实验。

本产品表达嘌呤霉素抗性基因，因此本产品感染培养的细胞后可以使用嘌呤霉素(ST551)筛选稳定表达的细胞株以用于后续研究。

碧云天的Lenti-CRE-TA-Luc-EF1α-Puro是复制缺陷型慢病毒。其3' LTR的增强子功能发生缺失，形成了自失活(Self-inactivating) 3' LTR，在感染普通的细胞后不能进行复制和扩增，从而有效降低了本产品在活体生物中的风险。

碧云天推荐的慢病毒感染不同种类体外培养细胞的MOI值参见下表。

Cell line	Tissue	Cancer/cell type	Species	MOI
A431	Epithelial	Carcinoma	Human	5
A549	Lung	Carcinoma	Human	5
Astrocytes	Nervous system	Primary	Human	1
B16-F10	Epithelial	Melanoma, metastatic	Mouse	5
BMM	Bone Marrow	Primary	Human	8
BxPC-3	Pancreas, epithelial	Adenocarcinoma	Human	10
H3255	Lung	Carcinoma, NSCLC	Human	10
HCT116	Colon	Carcinoma	Human	5
HeLa	Cervix	Carcinoma, epithelioid	Human	3
HEK293T	Kidney	Tumor	Human	5
Hepa1-6	Liver	Carcinoma	Mouse	3
HMVEC	Endothelial	Endothelial, microvascular	Human	100
HT-29	Colon	Adenocarcinoma	Human	3
HUVEC	Umbilicus	Endothelial cells	Human	100
Jurkat	Blood	Leukemia, Acute T cell	Human	10
LLC-1	Lung	Carcinoma	Mouse	6
LNCaP	Prostate	Carcinoma	Human	5
MM200	Skin	Melanoma	Human	5
MCF-7	Breast	Adenocarcinoma	Human	2
MDA-MB-231	Breast	Adenocarcinoma	Human	1
MM-AN	Skin	Melanoma, metastatic	Human	16
MMC	Breast	Carcinoma	Mouse	4
MRC-5	Lung, embryonic	Fibroblasts	Human	1
NB4	Blood	Leukemia, acute promyelocytic	Human	10
PC12	Adrenal gland	Pheochromocytoma	Rat	20
SKOV-3	Ovary	Adenocarcinoma	Human	15
U-2 OS	Bone	Osteosarcoma	Human	5

实验室常用的逆转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺相关病毒(AAV)和腺病毒(Adenovirus)的主要特征之间的比较和差别参见下表。具体的特定病毒的一些特征和下表相比可能会有一定差异。

	Retrovirus	Lentivirus	AAV	Adenovirus
Genome	ssRNA(+)	ssRNA(+)	ssDNA	dsDNA
Coat	Enveloped	Enveloped	Naked	Naked
Particle size	90-100nm	90-100nm	20-30nm	60-90nm
Genome size	7-10kb	9kb	5kb	38-39kb
Genome integration	Yes	Yes	No	No
Packaging capacity	2.5-5kb	2.5-6kb	2.5-4.5kb	3-8kb
Infection tropism	Dividing cells	Dividing and non-dividing cells	Dividing and non-dividing cells	Dividing and non-dividing cells
Relative Transduction Efficiency	ND	70%	70%	100%
Expression started	48-72h	48-72h	72-96h	24-48h
Expression duration	> 2 months	> 2 months	> 6 months	3-4 weeks
Expression level	Medium	Medium	Medium	High
Immune response	Low	Low	Very low	High
In vivo safety	Medium	Medium	High	Low
Titer before concentration (IFU/ml)	106	107	1011	107
Titer after concentration (IFU/ml)	ND	108	0.5-1×1013	1010
Able to obtain high MOI	No (≤ 10 copies integrated)	No (≤ 10 copies integrated)	Yes	Yes
Biosafety level	BSL-2	BSL-2	BSL-1	BSL-2

本产品的滴度不低于10^8TU/ml，适合细胞实验或活体动物实验。TU, transduction unit，即转导单位。TU通过本产品梯度稀释后感染HEK293T细胞后抽提细胞基因组DNA进行qPCR测定获得，以确定具有生物活性的病毒颗粒数量。MOI (Multiplicity of Infection)是病毒感染细胞时，病毒数量与细胞数量的比值。使用10^8TU/ml的本产品，如果按照5 MOI感染6孔板的细胞，每孔50万细胞计算，每100μl共可以感染4个孔；如果按照5 MOI感染24孔板的细胞，每孔10万细胞计算，每100μl共可以感染20个孔。如果MOI值提高，那么相应可以感染的孔数会减少；如果MOI值下调，那么相应可以感染的孔数会增加。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C4047-100μl	Lenti-CRE-TA-Luc-EF1α-Puro (10^8TU/ml, 报告基因慢病毒)	100μl
C4047-500μl	Lenti-CRE-TA-Luc-EF1α-Puro (10^8TU/ml, 报告基因慢病毒)	100μl×5
—	说明书	1份

保存条件：

-80ºC保存，一年有效。-20ºC保存，1-2个月内有效。4ºC保存，一周内有效。

注意事项：

反复冻融会降低病毒滴度，如有必要请在收到本产品后分装保存。分装时必须在冰浴上进行。病毒融解后，如果在一周内使用，可以放置于4ºC，但须注意4ºC存放时间越长，滴度下降越明显。如果-80ºC保存时间超过一年，可能会导致滴度下降，此时建议重新测定病毒滴度。

本产品使用前请仔细阅读附录1《慢病毒使用安全规范》。本产品生物安全等级为Biosafety Level 2 (BSL-2)，在按照常规的微生物实验操作要求进行操作(Standard microbiological practices)的基础上，还需要注意限制接触、生物危害提示、显著的警示标识、并制定相应的安全规范。

病毒操作中应注意有效防护，绝对禁止在生物安全柜内有任何皮肤直接暴露的情况。实验完成后，请及时清洗双手。严禁直接接触病毒，如意外接触，请及时用清水冲洗，并适当用70%乙醇对皮肤进行消毒。

任何接触过病毒的材料、试剂、样品，应经消毒处理，可以采用1%的SDS溶液、或84消毒液(1:20)浸泡30分钟以上，或121ºC高压灭菌30分钟。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 感染条件的确定。
MOI (Multiplicity of Infection)定义：病毒感染细胞时，病毒数量与细胞数量的比值。TU (Transduction Units)定义：具有生物活性的病毒颗粒数量。梯度稀释病毒后感染细胞，根据出现荧光的细胞数量或抽提细胞基因组DNA进行qPCR测定来确定具有生物活性的病毒颗粒数量。不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的，如果是初次使用慢病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件。理论上MOI值越高，慢病毒感染可能性越大，感染效率越高，对细胞的毒性也越大。所以预实验的目的是在保证细胞成活率的情况下，确定能够使感染效率达到适宜观察水平的MOI值。
a. 细胞培养(以24孔板HEK293T细胞为例，其它培养板或培养皿参考24孔板进行操作)：感染前一天，在24孔板中以约5×10⁴/孔接种HEK293T细胞，每孔加入0.5ml完全培养液，使第二天病毒感染时的细胞密度达到约70-80% (细胞数约1×10⁵)。
注：具体接种数量需根据细胞种类、细胞大小和细胞生长速度等因素而确定。
b. 设置MOI值分别为1、2、5、10、20，计算所需病毒量，计算公式如下：
TU = 感染时的细胞数*×MOI
病毒母液(μl) = TU /滴度(TU/ml)×1000
*一般第二天细胞数按接种细胞数增长1倍来计算，增殖较慢或不增殖的细胞可适当调整。
例如：需要向1×105个HEK293T细胞加入20 MOI的病毒，即所需TU = (1×10⁵ cells)×(20 MOI) = 2×10⁶TU。若病毒母液滴度为1×10⁸TU/ml，则细胞培养液中应加入病毒母液 = 2×10⁶TU / (1×10⁸TU/ml)×1000 = 20μl，即20μl病毒母液。
注：其它细胞株的预实验MOI设置可以参考本说明书中产品简介部分“碧云天推荐的慢病毒感染不同种类体外培养细胞的MOI值”表格或相关文献资料。
c. 按照下图设置MOI预实验组，建议设置复孔以确保实验准确性。尽量减少加入新鲜培养液的量，以提升后续病毒的感染效率。
注1：对于适合使用聚凝胺(Polybrene) (C0351/ST1380)处理的细胞(可以使感染效率提高约2-10倍)，弃旧培养液，每孔加入250μl含有6-8μg/ml polybrene的新鲜培养液；
注2：对于不适合使用polybrene处理的细胞(如末端分化的神经元、树突状细胞)，弃旧培养液，每孔加入250μl的新鲜培养液。 图1. 细胞感染MOI值预实验设计分组。MOI依次设置为：1、2、5、10、20。并同时设置加含6-8μg/ml polybrene的培养液实验组，不含polybrene的培养液实验组及Blank组(空白对照组)。Blank组可作为参照，以检验细胞生长状态。本图中实验设置仅供参考，用户应根据实际情况自行适当调整。
d. 取出本产品置于冰上解冻，混匀后，将根据特定MOI值计算好的病毒母液量分别加入细胞培养板中，轻轻混匀后继续培养。
注：如果病毒滴度太高，需加的病毒母液量较少或多孔板如96孔板和48孔板等培养液体积比较小的情况，可以先将病毒母液用培养液进行适当稀释后再加入。
e. 感染后约4小时，每孔补加250μl新鲜培养液。
f. 感染后约24小时，进行换液。弃含病毒的培养液，每孔加入新鲜的完全培养液，继续培养。
注：换液的具体时间需视细胞状态而定，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用，影响细胞生长状态，最短可于加病毒4小时后更换新鲜培养液。
g. 继续培养约48-96小时后观察细胞生长状况及荧光蛋白表达情况，以不显著影响细胞生长、荧光较强且感染效率便于荧光观察的MOI值和感染后时间为最佳条件。
h. 如果有必要，可以根据特定细胞加入适当浓度的嘌呤霉素(ST551)，以筛选被感染的细胞，后续可以通过稀释法等获取单克隆细胞株。嘌呤霉素的浓度可以通过梯度稀释的预实验来确定，以刚好能完全杀死目的细胞的浓度为宜。
注1：细胞并非感染效率越高越好，通常约20-70%的感染效率已经足以进行后续检测，感染效率过高反而容易产生细胞毒性而干扰检测。
注2：通常在慢病毒感染细胞后72小时即可观察到荧光蛋白表达的出现，在96小时左右有较强的表达效果。
注3：对于感染慢病毒后出现较强细胞毒性的情况，可以尝试在感染后4小时更换成新鲜的完全培养液。
2. 感染细胞和报告基因检测。
按照步骤1获得的条件进行病毒感染实验，可以在慢病毒感染细胞后48-96小时后，或者在筛选获得CRE-TA-Luc-EF1α-Puro的稳定表达细胞株后，采用Forskolin (腺苷酸环化酶激活剂) (S1612)刺激细胞6-24小时，Steady-Lumi™萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG058)等检测萤火虫萤光素酶表达情况。
附录：
1. 慢病毒使用安全规范。
a. 作为一种相对安全的病毒，尽管慢病毒在正常细胞内不能进行复制和扩增，但是慢病毒基因组可以整合到被感染细胞的基因组中，因此仍然具有可能的潜在生物学危险。我们建议使用者在病毒操作前应仔细阅读本规范，并在实验中严格按照本规范的要求进行操作。更为严格的美国CDC的生物安全等级及其操作与防护要求参考附表1，也可以访问如下网页：https://www.cdc.gov/labs/bmbl/index.html。
b. 慢病毒操作时应使用相应级别的生物安全柜，不同的慢病毒的生物安全等级会有所不同。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机，以尽量避免可能污染病毒的尘埃正面吹向操作人员而被吸入。
c. 实验操作时必需佩戴一次性帽子、口罩，穿戴实验手套及专门的实验服，避免身体直接接触病毒。手部及面部有开放性创口时，禁止进行病毒操作。
d. 操作病毒时需小心谨慎，不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台或其它器皿上有病毒污染，请立即用70%乙醇或2% SDS溶液擦拭干净，或者采取其它的妥善措施。
e. 如果需要离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜密封后离心，最好使用专门的离心机。
f. 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70%乙醇清理培养瓶或培养板外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇擦洗显微镜实验台。
g. 所有被病毒污染过的枪头、离心管、培养板(皿、瓶)、培养液、手套等，在丢弃前请用84消毒液或2% SDS浸泡过夜。
h. 脱掉手套后，用肥皂或洗手液清洗双手。
i. 病毒飞溅或是含有病毒的气溶胶与人体接触，须用大量清水冲洗眼睛、皮肤或粘膜等接触的部位至少15min。
j. 含病毒的针头或是其它利器刺破皮肤，伤口应立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟，然后用大量清水冲洗。
k. 装盛慢病毒的实验用品需单独放置，并须加以适当标示。
l. 对同实验室的人员须进行慢病毒安全培训或安全警示。
2. 生物安全等级及其操作与防护要求。
Summary of Recommended Biosafety Levels for Infectious Agents

BSL	Agents	Practices	Primary Barriers and Safety Equipment	Facilities (Secondary Barriers)
1	Not known to consistently cause diseases in healthy adults	Standard microbiological practices	■ No primary barriers required. ■ PPE: laboratory coats and gloves; eye, face protection, as needed	Laboratory bench and sink required
2	■ Agents associated with human disease ■ Routes of transmission include percutaneous injury, ingestion, mucous membrane exposure	BSL-1 practice plus: ■ Limited access ■ Biohazard warning signs ■ “Sharps” precautions ■ Biosafety manual defining any needed waste decontamination or medical surveillance policies	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all manipulations of agents that cause splashes or aerosols of infectious materials ■ PPE: Laboratory coats, gloves, face and eye protection, as needed	BSL-1 plus: ■ Autoclave available
3	Indigenous or exotic agents that may cause serious or potentially lethal disease through the inhalation route of exposure	BSL-2 practice plus: ■ Controlled access ■ Decontamination of all waste ■ Decontamination of laboratory clothing before laundering	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all open manipulations of agents ■ PPE: Protective laboratory clothing, gloves, face, eye and respiratory protection, as needed	BSL-2 plus: ■ Physical separation from access corridors ■ Self-closing, double-door access ■ Exhausted air not recirculated ■ Negative airflow into laboratory ■ Entry through airlock or anteroom ■ Hand washing sink near laboratory exit
4	■ Dangerous/exotic agents which post high individual risk of aerosol-transmitted laboratory infections that are frequently fatal, for which there are no vaccines or treatments ■ Agents with a close or identical antigenic relationship to an agent requiring BSL-4 until data are available to redesignate the level ■ Related agents with unknown risk of transmission	BSL-3 practices plus: ■ Clothing change before entering ■ Shower on exit ■ All material decontaminated on exit from facility	Primary barriers: ■ All procedures conducted in Class III BSCs or Class I or II BSCs in combination with full-body, air-supplied, positive pressure suit	BSL-3 plus: ■ Separate building or isolated zone ■ Dedicated supply and exhaust, vacuum, and decontamination systems ■ Other requirements outlined in the text

BSL, biosafety level; PPE, personal protective equipment.
参考文献：
1. Yamamoto KK, Gonzalez GA, Biggs WH 3rd, Montminy MR. Nature. 1988. 334(6182):494-8.
2. Carlezon WA Jr, Duman RS, Nestler EJ. Trends Neurosci. 2005. 28(8):436-45.
3. Li J, Chen L, Du L, Li M. Chem Soc Rev. 2013. 42(2):662-76.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
C4047-100μl	Lenti-CRE-TA-Luc-EF1α-Puro (10^8TU/ml, 报告基因慢病毒)	100μl
C4047-500μl	Lenti-CRE-TA-Luc-EF1α-Puro (10^8TU/ml, 报告基因慢病毒)	500μl
C4053-100μl	Lenti-CMV-GLP1R-IRES-BSD (10^8TU/ml)	100μl
C4053-500μl	Lenti-CMV-GLP1R-IRES-BSD (10^8TU/ml)	500μl