Lenti-CMV-CD63-EGFP，即Lentivirus expressing CD63-EGFP fusion protein，是碧云天自行研发的一种可以在大多数哺乳动物细胞(包括原代细胞和干细胞)中通过CMV启动子表达人源CD63-EGFP融合蛋白的重组慢病毒。本产品可用于外泌体的示踪研究，用于研究外泌体的形成、分泌、靶向和运输机制。本产品带有嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因，感染细胞后可以使用嘌呤霉素筛选稳定株。

外泌体(Exosome)是膜包裹的细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，直径约为40-160nm，具有脂质双分子层结构，天然存在于血液、尿液、脑脊液，以及体外培养细胞的上清液中[1]，几乎所有类型的细胞都可以产生并释放外泌体[2]。如图1所示，细胞膜内吞(Endocytosis)依次形成初级内体(Early sorting endosome, ESE)、次级内体(Late sorting endosome, LSE)和多囊泡体(Multivesicular body, MVB)，其中多囊泡体包含腔内囊泡(Intraluminal vesicles, ILVs)。多囊泡体与细胞膜融合形成外泌体，外泌体携带多种来自其母体细胞的成分(包括核酸、蛋白质、脂类和代谢物等)释放到胞外基质中[3]。外泌体可以被附近或远距离的细胞识别和融合，是细胞间进行相互调控的重要媒介，参与了癌症、神经退行性病变和炎症性疾病等多种疾病的发病过程，影响细胞多方面的功能[4-5]。

图1. 外泌体的形成原理及其携带的母体细胞成分示意图。

外泌体标志蛋白(Protein biomarkers for exosome)，也称外泌体蛋白标志物(Protein markers for exosome)，可以用于鉴定、观察、标记和纯化外泌体。据外泌体据库(ExoCarta, http://www.exocarta.org)统计来自不同生物、细胞类型和体液的外泌体中已发现9769种蛋白质，ExoCarta列出了100种常见外泌体蛋白标志物(http://exocarta.org/exosome_markers_new)，其中CD9、CD63、CD81、Alix、Flotillin、Ceramide和Tumor susceptibility gene 101 (TSG101)是最常用的外泌体蛋白标志物(如图2所示[3])。CD63在人体中由CD63基因编码的蛋白质抗原，是跨膜四超家族(Transmembrane 4 superfamily)成员之一，为4次跨膜蛋白[1]，大量存在于细胞外囊泡的表面，也会出现在普通的细胞膜表面。CD63是最常用的外泌体蛋白标志物之一，被认为是调控细胞外囊泡产生和胞内物质分选的关键因子[6]。

图2. 常见的外泌体蛋白标志物示意图。

Lenti-CMV-CD63-EGFP感染HEK293T细胞后的表达效果如图3所示。

图3. 碧云天生产的Lenti-CMV-CD63-EGFP (C4011)感染HEK293T细胞的效果图。96孔板每孔10,000个细胞，培养过夜后用相应的病毒TU数进行感染，病毒感染72小时后荧光显微镜实拍相同大小视野效果图。实际检测效果会因检测仪器、实验条件的不同而存在差异，本图仅供参考。

慢病毒感染细胞后会将目的基因随机整合到基因组DNA上，因而可以长期稳定地表达目的蛋白，并且几乎可以感染所有哺乳动物细胞，在很多不分裂的细胞中也可以长期稳定表达，广泛应用于细胞和动物实验。

本产品表达嘌呤霉素抗性基因，因此本产品感染培养的细胞后可以使用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株以用于后续研究。

碧云天的Lenti-CMV-CD63-EGFP是复制缺陷型慢病毒。其3' LTR的增强子功能发生缺失，形成了自失活(self-inactivating) 3' LTR，并且5' LRT中的U3区域替换成CMV启动子，在感染普通的细胞后不能进行复制和扩增，从而有效降低了本产品在活体生物中的风险。

碧云天推荐的慢病毒感染不同种类体外培养细胞的MOI值参见下表。

Cell line	Tissue	Cancer/cell type	Species	MOI
A431	Epithelial	Carcinoma	Human	5
A549	Lung	Carcinoma	Human	5
Astrocytes	Nervous system	Primary	Human	1
B16-F10	Epithelial	Melanoma, metastatic	Mouse	5
BMM	Bone Marrow	Primary	Human	8
BxPC-3	Pancreas, epithelial	Adenocarcinoma	Human	10
H3255	Lung	Carcinoma, NSCLC	Human	10
HCT116	Colon	Carcinoma	Human	5
HeLa	Cervix	Carcinoma, epithelioid	Human	3
HEK293T	Kidney	Tumor	Human	5
Hepa1-6	Liver	Carcinoma	Mouse	3
HMVEC	Endothelial	Endothelial, microvascular	Human	100
HT-29	Colon	Adenocarcinoma	Human	3
HUVEC	Umbilicus	Endothelial cells	Human	100
Jurkat	Blood	Leukemia, Acute T cell	Human	10
LLC-1	Lung	Carcinoma	Mouse	6
LNCaP	Prostate	Carcinoma	Human	5
MM200	Skin	Melanoma	Human	5
MCF-7	Breast	Adenocarcinoma	Human	2
MDA-MB-231	Breast	Adenocarcinoma	Human	1
MM-AN	Skin	Melanoma, metastatic	Human	16
MMC	Breast	Carcinoma	Mouse	4
MRC-5	Lung, embryonic	Fibroblasts	Human	1
NB4	Blood	Leukemia, acute promyelocytic	Human	10
PC12	Adrenal gland	Pheochromocytoma	Rat	20
SKOV-3	Ovary	Adenocarcinoma	Human	15
U-2 OS	Bone	Osteosarcoma	Human	5

实验室常用的逆转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺相关病毒(AAV)和腺病毒(Adenovirus)的主要特征之间的比较和差别参见下表。具体的特定病毒的一些特征和下表相比可能会有一定差异。

	Retrovirus	Lentivirus	AAV	Adenovirus
Genome	ssRNA(+)	ssRNA(+)	ssDNA	dsDNA
Coat	Enveloped	Enveloped	Naked	Naked
Particle size	90-100nm	90-100nm	20-30nm	60-90nm
Genome size	7-10kb	9kb	5kb	38-39kb
Genome integration	Yes	Yes	No	No
Packaging capacity	2.5-5kb	2.5-6kb	2.5-4.5kb	3-8kb
Infection tropism	Dividing cells	Dividing and non-dividing cells	Dividing and non-dividing cells	Dividing and non-dividing cells
Relative Transduction Efficiency	ND	70%	70%	100%
Expression started	48-72h	48-72h	72-96h	24-48h
Expression duration	> 2 months	> 2 months	> 6 months	3-4 weeks
Expression level	Medium	Medium	Medium	High
Immune response	Low	Low	Very low	High
In vivo safety	Medium	Medium	High	Low
Titer before concentration (IFU/ml)	106	107	1011	107
Titer after concentration (IFU/ml)	ND	108	0.5-1×1013	1010
Able to obtain high MOI	No (≤ 10 copies integrated)	No (≤ 10 copies integrated)	Yes	Yes
Biosafety level	BSL-2	BSL-2	BSL-1	BSL-2

本产品的滴度不低于10^9TU/ml，适合细胞实验或活体动物实验。TU, transduction unit，即转导单位。TU通过本产品梯度稀释后感染HEK293T细胞后测定获得，能让一个HEK293T细胞呈现绿色荧光的活力单位定义为1TU。MOI (Multiplicity of Infection)是病毒感染细胞时，病毒数量与细胞数量的比值。使用10^9TU/ml的本产品，如果按照5 MOI感染6孔板的细胞，每孔50万细胞计算，100μl共可以感染40个孔；如果按照5 MOI感染24孔板的细胞，每孔10万细胞计算，100μl共可以感染200个孔。如果MOI值提高，相应可以感染的孔数会减少；如果MOI值下调，相应可以感染的孔数会增加。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C4011-100μl	Lenti-CMV-CD63-EGFP (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl
C4011-500μl	Lenti-CMV-CD63-EGFP (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl×5
－	说明书	1份

保存条件：

-80℃保存，一年有效。-20℃保存，1-2个月内有效。4℃保存，一周内有效。

注意事项：

反复冻融会降低病毒滴度，如有必要请在收到本产品后分装保存。分装时必须在冰浴上进行。病毒融解后，如果在一周内使用，可以放于4℃，但须注意4℃存放时间越长，滴度下降越明显。如果-80℃保存时间超过一年，可能会导致滴度下降，此时建议重新测定病毒滴度。

本产品使用前请仔细阅读附录1《慢病毒使用安全规范》。本产品生物安全等级为Biosafety Level 2 (BSL-2)，在按照常规的微生物实验操作要求进行操作(Standard microbiological practices)的基础上，还需要注意限制接触、生物危害提示、显著的警示标识、并制定相应的安全规范。

病毒操作中应注意有效防护，绝对禁止在生物安全柜内有任何皮肤直接暴露的情况。实验完成后，请及时清洗双手。严禁直接接触病毒，如意外接触，请及时用清水冲洗，并适当用70%乙醇对皮肤进行消毒。

任何接触过病毒的材料、试剂、样品，应经消毒处理，可以采用1%的SDS溶液、或84消毒液(1:20)浸泡30分钟以上，或121℃高压灭菌30分钟。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.感染条件的确定：
MOI (Multiplicity of Infection)定义：病毒感染细胞时，病毒数量与细胞数量的比值。TU (Transduction Units)定义：具有生物活性的病毒颗粒数量。梯度稀释病毒后感染细胞，根据出现荧光的细胞数量或抽提细胞基因组DNA进行qPCR测定来确定具有生物活性的病毒颗粒数量。不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的，如果是初次使用慢病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件。理论上MOI值越高，慢病毒感染可能性越大，感染效率越高，对细胞的毒性也越大。所以预实验的目的是在保证细胞成活率的情况下，确定能够使感染效率达到适宜观察水平的MOI值。
a.细胞培养(以24孔板HEK293T细胞为例，其它培养板或培养皿参考24孔板进行操作)：感染前一天，在24孔板中以约5×10⁴/孔接种HEK293T细胞，每孔加入0.5ml完全培养液，使第二天病毒感染时的细胞密度达到约70-80% (细胞数约1×10⁵)。注：具体接种数量需根据细胞种类、细胞大小和细胞生长速度等因素而确定。
b.设置MOI值分别为1、2、5、10、20，计算所需病毒量，计算公式如下：
TU = 感染时的细胞数* × MOI
病毒母液(μl) = TU / 滴度(TU/ml) × 1000
*一般第二天细胞数按接种细胞数增长1倍来计算，增殖较慢或不增殖的细胞可适当调整。
例如：需要向1×10⁵个HEK293T细胞加入20 MOI的病毒，即所需TU = (1×10⁵ cells) × (20 MOI) = 2×10⁶ TU。若病毒母液滴度为1×10⁹ TU/ml，则细胞培养液中应加入病毒母液 = 2×10⁶ TU / (1×10⁹ TU/ml) × 1000 = 2μl，即2μl病毒母液。
注：其它细胞株的预实验MOI设置可以参考本说明书中产品简介部分“碧云天推荐的慢病毒感染不同种类体外培养细胞的MOI值”表格或相关文献资料。
c.按照下图设置MOI预实验组，建议设置复孔以确保实验准确性。注：对于适合使用聚凝胺(polybrene) (C0351/ST1380)处理的细胞，弃旧培养液，每孔加入250μl含有6-8μg/ml polybrene的新鲜培养液；对于不适合使用polybrene处理的细胞，弃旧培养液，每孔加入250μl的新鲜培养液。使用polybrene可以使感染效率提高约2-10倍，并且病毒测定其活力的时候是使用polybrene的。须特别注意此时宜加入尽量少的新鲜培养液，以提升后续病毒的感染效率。
图4.细胞感染MOI值预实验设计分组。MOI依次设置为：1、2、5、10、20。并同时设置加含6-8μg/ml polybrene的培养液实验组，不含polybrene的培养液实验组及Blank组(空白对照组)。Blank组可作为参照，以检验细胞生长状态。本图中实验设置仅供参考，用户应根据实际情况自行适当调整。
d.取出本产品置于冰上解冻，混匀后，将根据特定MOI值计算好的病毒母液量分别加入细胞培养板中，轻轻混匀后继续培养。注：如果病毒滴度太高，需加的病毒母液量较少或多孔板如96孔板和48孔板等培养液体积比较小的情况，可以先将病毒母液用培养液进行适当稀释后再加入。
e.感染后约4小时，每孔补加250μl新鲜培养液。
f.感染后约24小时，进行换液。弃含病毒的培养液，每孔加入新鲜的完全培养液，继续培养。注：换液的具体时间需视细胞状态而定，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用，影响细胞生长状态，最短可于加病毒4小时后更换新鲜培养液。
g.继续培养约48-96小时后观察细胞生长状况及荧光蛋白表达情况，以不显著影响细胞生长、荧光较强且感染效率便于荧光观察的MOI值和感染后时间为最佳条件。
h.如果有必要，可以根据特定细胞加入适当浓度的嘌呤霉素(Puromycin) (ST551)，以筛选被感染的细胞，后续可以通过稀释法等获取单克隆细胞株。嘌呤霉素的浓度可以通过梯度稀释的预实验来确定，以刚好能完全杀死目的细胞的浓度为宜。
注1：细胞并非感染效率越高越好，通常约20-70%的感染效率已经足以进行后续检测，感染效率过高反而容易产生细胞毒性而干扰检测。
注2：通常在慢病毒感染细胞后72小时即可观察到荧光蛋白表达的出现，在96小时左右有较强的表达效果。
注3：对于感染慢病毒后出现较强细胞毒性的情况，可以尝试在感染后4小时更换成新鲜的完全培养液。
2.感染细胞和荧光观察：
按照步骤1获得的条件进行病毒感染实验，在观察到CD63-EGFP的红色荧光后，或者在筛选获得CD63-EGFP的稳定表达细胞株后，进行后续实验。
附录：
1.慢病毒使用安全规范：
a.作为一种相对安全的病毒，尽管慢病毒在正常细胞内不能进行复制和扩增，但是慢病毒基因组可以整合到被感染细胞的基因组中，因此仍然具有可能的潜在生物学危险。我们建议使用者在病毒操作前应仔细阅读本规范，并在实验中严格按照本规范的要求进行操作。更为严格的美国CDC的生物安全等级及其操作与防护要求参考附表1，也可以访问如下网页：https://www.cdc.gov/labs/pdf/CDC-BiosafetyMicrobiologicalBiomedicalLaboratories-2020-P.pdf。
b.慢病毒操作时应使用相应级别的生物安全柜，不同的慢病毒的生物安全等级会有所不同。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机，以尽量避免可能污染病毒的尘埃正面吹向操作人员而被吸入。
c.实验操作时必需佩戴一次性帽子、口罩，穿戴实验手套及专门的实验服，避免身体直接接触病毒。手部及面部有开放性创口时，禁止进行病毒操作。
d.操作病毒时需小心谨慎，不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台或其它器皿上有病毒污染，请立即用70%乙醇或2% SDS溶液擦拭干净，或者采取其它的妥善措施。
e.如果需要离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜密封后离心，最好使用专门的离心机。
f.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70%乙醇清理培养瓶或培养板外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇擦洗显微镜实验台。
g.所有被病毒污染过的枪头、离心管、培养板(皿、瓶)、培养液、手套等，在丢弃前请用84消毒液或2% SDS浸泡过夜。
h.脱掉手套后，用肥皂或洗手液清洗双手。
i.病毒飞溅或是含有病毒的气溶胶与人体接触，须用大量清水冲洗眼睛、皮肤或粘膜等接触的部位至少15min。
j.含病毒的针头或是其它利器刺破皮肤，伤口应立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟，然后用大量清水冲洗。
k.装盛慢病毒的实验用品需单独放置，并须加以适当标示。
l.对同实验室的人员须进行慢病毒安全培训或安全警示。
2.生物安全等级及其操作与防护要求：
Summary of Recommended Biosafety Levels for Infectious Agents

BSL	Agents	Practices	Primary Barriers andSafety Equipment	Facilities(Secondary Barriers)
1	Not known to consistently cause diseases in healthy adults	Standard microbiological practices	■ No primary barriers required. ■ PPE: laboratory coats and gloves; eye, face protection, as needed	Laboratory bench and sink required
2	■ Agents associated with human disease ■ Routes of transmission include percutaneous injury, ingestion, mucous membrane exposure	BSL-1 practice plus: ■ Limited access ■ Biohazard warning signs ■ “Sharps” precautions ■ Biosafety manual defining any needed waste decontamination or medical surveillance policies	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all manipulations of agents that cause splashes or aerosols of infectious materials ■ PPE: Laboratory coats, gloves, face and eye protection, as needed	BSL-1 plus: ■ Autoclave available
3	Indigenous or exotic agents that may cause serious or potentially lethal disease through the inhalation route of exposure	BSL-2 practice plus: ■ Controlled access ■ Decontamination of all waste ■ Decontamination of laboratory clothing before laundering	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all open manipulations of agents ■ PPE: Protective laboratory clothing, gloves, face, eye and respiratory protection, as needed	BSL-2 plus: ■ Physical separation from access corridors ■ Self-closing, double-door access ■ Exhausted air not recirculated ■ Negative airflow into laboratory ■ Entry through airlock or anteroom ■ Hand washing sink near laboratory exit
4	■ Dangerous/exotic agents which post high individual risk of aerosol-transmitted laboratory infections that are frequently fatal, for which there are no vaccines or treatments ■ Agents with a close or identical antigenic relationship to an agent requiring BSL-4 until data are available to redesignate the level ■ Related agents with unknown risk of transmission	BSL-3 practices plus: ■ Clothing change before entering ■ Shower on exit ■ All material decontaminated on exit from facility	Primary barriers: ■ All procedures conducted in Class III BSCs or Class I or II BSCs in combination with full-body, air-supplied, positive pressure suit	BSL-3 plus: ■ Separate building or isolated zone ■ Dedicated supply and exhaust, vacuum, and decontamination systems ■ Other requirements outlined in the text

BSL, biosafety level; PPE, personal protective equipment.
参考文献：
1.Metzelaar MJ, Wijngaard PL, Peters PJ, Sixma JJ, Nieuwenhuis HK, Clevers HC. J Biol Chem. 1991. 15;266(5):3239-45.
2.Luo W, Dai Y, Chen Z, Yue X, Andrade-Powell KC, Chang J. Commun Biol. 2020. 10;3(1):114.
3.Kalluri R, LeBleu VS. Science. 2020. 367(6478).
4.He C, Zheng S, Luo Y, Wang B. Theranostics. 2018. 1;8(1):237-255.
5.Zhang Y, Bi J, Huang J, Tang Y, Du S, Li P. Int J Nanomedicine. 2020. 22;15:6917-6934.
6.Mathieu M, Névo N, Jouve M, Valenzuela JI, Maurin M, Verweij FJ, Palmulli R, Lankar D, Dingli F, Loew D, Rubinstein E, Boncompain G, Perez F, Théry C. Nat Commun. 2021. 12(1):4389.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
C4007-100μl	Lenti-CMV-CD9-EGFP (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl
C4007-500μl	Lenti-CMV-CD9-EGFP (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl×5
C4009-100μl	Lenti-CMV-CD9-mCherry (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl
C4009-500μl	Lenti-CMV-CD9-mCherry (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl×5
C4011-100μl	Lenti-CMV-CD63-EGFP (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl
C4011-500μl	Lenti-CMV-CD63-EGFP (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl×5
C4013-100μl	Lenti-CMV-CD63-mCherry (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl
C4013-500μl	Lenti-CMV-CD63-mCherry (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl×5
C4015-100μl	Lenti-CMV-CD81-EGFP (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl
C4015-500μl	Lenti-CMV-CD81-EGFP (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl×5
C4017-100μl	Lenti-CMV-CD81-mCherry (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl
C4017-500μl	Lenti-CMV-CD81-mCherry (10^9TU/ml,外泌体示踪用)	100μl×5
D2831-1μg	pCMV-CD81-EGFP (外泌体示踪用)	1μg
D2831-100μg	pCMV-CD81-EGFP (外泌体示踪用)	100μg
D2833-1μg	pCMV-CD81-mCherry (外泌体示踪用)	1μg
D2833-100μg	pCMV-CD81-mCherry (外泌体示踪用)	100μg
D2835-1μg	pCMV-CD9-EGFP (外泌体示踪用)	1μg
D2835-100μg	pCMV-CD9-EGFP (外泌体示踪用)	100μg
D2837-1μg	pCMV-CD9-mCherry (外泌体示踪用)	1μg
D2837-100μg	pCMV-CD9-mCherry (外泌体示踪用)	100μg
D2839-1μg	pCMV-CD63-EGFP (外泌体示踪用)	1μg
D2839-100μg	pCMV-CD63-EGFP (外泌体示踪用)	100μg
D2841-1μg	pCMV-CD63-mCherry (外泌体示踪用)	1μg
D2841-100μg	pCMV-CD63-mCherry (外泌体示踪用)	100μg