碧云天生产的多能干细胞免疫荧光检测试剂盒(Sox2, 兔抗, 红色荧光)，英文名为Pluripotent Stem Cell Immunofluorescence Assay Kit (Sox2 Rabbit pAb, Red)，是一种通过免疫荧光染色法检测多能干细胞未分化(undifferentiated)状态的标志物Sox2的多能干细胞检测试剂盒。

本试剂盒中的Sox2兔多抗特异性识别人或小鼠的Sox2，可以结合荧光显微镜或高内涵筛选(High content screening, HCS)等，广泛应用于iPS重编程效果的判定，多能干细胞的干性(stemness)评估，以及干细胞的分化检测等。

本试剂盒提供了固定液、洗涤液、封闭液、一抗、荧光标记二抗、细胞核荧光染色液、封片液，使用时不必再配制其它任何溶液。提供了细胞核荧光染色液，可以把细胞核染成蓝色荧光。使用本试剂盒检测小鼠胚胎干细胞E14TG2a和NIH3T3细胞的效果参考图1。

图1.碧云天多能干细胞免疫荧光检测试剂盒(Sox2, 兔抗, 红色荧光)检测小鼠胚胎干细胞E14TG2a、NIH3T3细胞的染色效果图。小鼠胚胎干细胞E14TG2a去除MEF接种至铺有C0316 BeyoEmbryo™ 0.1%明胶溶液(胚胎细胞培养级)的六孔板中。培养2-3天后使用本试剂盒做免疫荧光染色。NIH3T3作为阴性对照细胞核无红色荧光，而小鼠胚胎干细胞E14TG2a细胞核呈现Sox2阳性染色。实际染色效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒中提供的封闭液为碧云天的QuickBlock™免疫染色封闭液，仅10分钟左右即可完成封闭。

使用本试剂盒染色后Sox2呈红色荧光，其最大激发波长为555nm，最大发射波长为565nm；细胞核呈蓝色荧光，其最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。

转录因子Sox2是SOX区域Y相关HMG (High Mobility Group)蛋白家族成员之一。Sox蛋白家族在哺乳动物器官早期发育中发挥重要的作用，尤其是转录因子Sox2，它是调节哺乳动物胚胎发育的必要因子之一。Sox2和Sox3分别在早期胚胎植入和外胚层形成过程中发挥重要作用，后期则在胚胎神经上皮呈现限制性表达[1,2]。Sox2也是维持胚胎干细胞(Embryonic cells, ES)自我更新和多潜能性的必要条件，且Sox2的表达受到严格的调控[3]。在ES细胞中，Sox2水平的微小变化可以触发向多种细胞类型的分化[4] 。Oct4 (POU5F1)、Klf4、c-myc和Sox2是最初用于将分化的小鼠和人类细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)的四个因子[5]。另外，Sox2的异常表达还与多种癌症类型有关，包括结直肠癌和乳腺癌[6]。

如果检测96孔板内的样品，本试剂盒可以检测100-500个样品(抗体重复使用0-4次)；如果用于检测6孔板内的样品，通常可以检测25-50个样品(抗体重复使用4-9次)；如果检测组织切片至少可以检测50个样品。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C3266-1	固定液	50ml
C3266-2	洗涤液	500ml
C3266-3	免疫荧光染色封闭液	50ml
C3266-4	Sox2兔多抗	5ml
C3266-5	驴抗兔555	5ml
C3266-6	细胞核染色液(DAPI)	50ml
C3266-7	抗荧光淬灭封片液	10ml
—	说明书	1份

保存条件：

固定液、细胞核染色液(DAPI) -20ºC保存，其余试剂均4ºC保存，半年有效。其中驴抗兔555和细胞核染色液(DAPI)须避光保存。

注意事项：

固定液对人体有害，操作时请特别小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

免疫荧光染色时，请注意回收使用过的一抗和二抗。回收后通常至少可以重复使用5次，如果出现浑浊、沉淀等异常现象，应停止使用。

需使用可以观察红色荧光和蓝色荧光的荧光显微镜或高内涵分析仪。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.对于贴壁细胞：
a.吸除培养液，用PBS洗涤1次。
b.加入固定液，固定5-15分钟。固定液的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常每孔加入1ml固定液。对于96孔板中的样品，通常每孔加入100μl固定液，其它多孔板的用量可以适当参考执行，后续以6孔板为例进行描述。
c.吸除固定液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完时吸尽洗涤液。
d.加入免疫染色封闭液，室温封闭10-20分钟。免疫染色封闭液的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常加入1ml免疫染色封闭液。
e.吸除免疫染色封闭液，加入Sox2兔多抗(一抗)，室温孵育1小时或4ºC孵育过夜。一抗的用量充分盖住样品即可，对于6孔板或96孔板中的样品，通常分别加入1ml或50μl一抗。
f.小心吸出一抗到适当的容器内，4ºC保存，留做下次使用。注：一抗通常至少可以重复使用5次。
g.洗涤液洗涤3次，每次5-10分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完时吸尽洗涤液。
h.加入驴抗兔555 (二抗)，室温孵育1小时。二抗的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常加入1ml二抗。
i.小心吸出二抗到适当的容器内，4ºC保存，留做下次使用。注：二抗通常至少可以重复使用5次。
j.洗涤液洗涤2次，每次5-10分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完时吸尽洗涤液。
k.加入细胞核染色液(DAPI)，室温染色5分钟左右。细胞核染色液的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常加入1ml细胞核染色液(DAPI)。
l.吸除细胞核染色液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完时吸尽洗涤液。
m.如果是6孔板等较大的孔板，可以滴加适当量的抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片后荧光显微镜下观察。如果是96孔板，通常可以在保留洗涤液的情况下直接进行观察和拍照，或使用高内涵分析仪进行拍照分析。Sox2的染色为红色荧光，细胞核的DAPI染色为蓝色荧光。
2.对于悬浮细胞：
a.离心收集细胞，PBS洗涤1次。吸尽PBS后把细胞适当弹散。
b.加入固定液，轻轻悬浮细胞，固定5-15分钟。
c.离心，去除固定液。
d.加入洗涤液洗涤1次。
e.取少许洗涤液重悬细胞，滴加到盖玻片或载玻片上，做成涂片。充分晾干后继续后续操作。
f.洗涤液洗涤2次，每次5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完毕时吸尽洗涤液。
g.转1.d。后续步骤同1.d起的步骤。或者也可以采用滴染的方法，具体参考如下的步骤。
h.使用免疫组化笔画圈并干燥。
i.滴加适量免疫染色封闭液，以充分覆盖样品并且不溢出圈为宜。湿盒内孵育10-20分钟。
j.吸除免疫染色封闭液，滴加适量一抗，以适当覆盖样品并且不溢出圈为宜，湿盒内室温孵育1小时或4ºC孵育过夜。
k.吸除一抗，洗涤液洗涤3次，每次用洗涤液孵育5-10分钟。更换洗涤液过程中保持样品湿润，避免干燥。最后一次洗涤完毕时吸尽洗涤液。
l.滴加适量二抗，以适当覆盖样品并且不溢出圈为宜，湿盒内室温孵育1小时。
m.吸除二抗，洗涤液洗涤2-3次，每次用洗涤液孵育5-10分钟。更换洗涤液过程中保持样品湿润，避免干燥。最后一次洗涤完毕时吸尽洗涤液。
n.滴加适量细胞核染色液(DAPI)，适当覆盖样品并不溢出圈即可，室温孵育5分钟左右。
o.吸除细胞核染色液(DAPI)，洗涤液洗涤3次，每次用洗涤液孵育3-5分钟。更换洗涤液过程中保持样品湿润，避免干燥。最后一次洗涤完毕时吸尽洗涤液。
p.滴加适量的抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片后荧光显微镜下观察。Sox2的染色为红色荧光，细胞核的DAPI染色为蓝色荧光。
3.对于组织切片：
a.对于石蜡切片先进行常规的脱蜡和水化处理，对于冷冻切片可以直接进行后续步骤。
b.转1.b。后续步骤同1.b起的步骤。或者也可以采用滴染的方法，具体可以转2.h起的步骤。
参考文献：
1.Chaudhary S, Islam Z, Mishra V, Rawat S, Ashraf GM, et al. Curr Protein Pept Sci. 2019. 20(6):495-504. 
2.Gou Y, Guo J, Maulding K, Riley BB. Dev Biol. 2018. 435(1):84-95. 
3.Rodda DJ, Chew JL, Lim LH, Loh YH, Wang B, et al. J Biol Chem. 2005. 280(26):24731-7.
4.Angie, Rizzino. Systems Biology and Medicine. 2009. 1(2):228-236.
5.Kazutoshi, Takahashi, Shinya Yamanaka. Cell. 2006. 126(4) : 663-676.
6.Novak D, Hüser L, Elton JJ, Umansky V, Altevogt P, et al. Semin Cancer Biol. 2020. 67(Pt 1):74-82. 
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