AAV-mCherry-GFP-LC3B (AAV9)，即AAV9 serotype adeno-associated virus (AAV) expressing mCherry-GFP-LC3B fusion protein，是一种可表达mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺相关病毒，用于注射小鼠等动物后进行细胞自噬(autophagy)检测。
LC3是酵母自噬关键蛋白ATG8在哺乳动物中的同源蛋白。LC3最初被分析鉴定为microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3)。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亚家族，其中对于LC3B的研究最为广泛。到目前为止，LC3B被认为是细胞自噬信号通路最为关键的标志性蛋白。LC3B是一个具有125个氨基酸残基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22个氨基酸蛋白，从而暴露出C端的甘氨酸，人们把它命名为胞质形式的LC3B I。在细胞自噬的过程中，其C端暴露的甘氨酸经过一个类似泛素化的过程，以ATG7为E1样激活酶(E1-like activating enzyme)，以ATG3为E2样连接酶(E2-like conjugation enzyme)，以Atg12-Atg5-Atg16复合物为E3样连接酶(E3-like ligase)，在C端甘氨酸上共价连接上磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)而成为LC3B-PE即LC3B II。与胞质定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬体(autophagosome)的内膜和外膜上。在自噬体与溶酶体融合后，自噬体外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬体内膜上的LC3B II则被溶酶体内的蛋白酶所降解。尽管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其极强的疏水性，在SDS-PAGE电泳时，LC3B II比LC3B I迁移得更快，其表观分子量分别为14kD和16kD。
自噬(Autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关，在饥饿等不利的环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个新的研究热点。
AAV-mCherry-GFP-LC3B是碧云天自行研发的重组腺相关病毒，感染后能够在靶细胞中有效表达红色荧光蛋白mCherry、绿色荧光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈现明亮的红色和绿色荧光，可以用于细胞自噬的检测。
自噬小体在与溶酶体融合过程中，溶酶体内的酸性环境会导致GFP荧光淬灭，这为追踪GFP-LC3B的细胞定位增加了难度。mCherry是一种来自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的单体红色荧光蛋白，当其与GFP进行LC3B的共同标记时，在GFP被溶酶体酸性环境所淬灭的情况下，可以发出红色荧光的mCherry因为其卓越的稳定性而被保留。因此，通过融合表达mCherry-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追踪自噬过程。在用AAV-mCherry-GFP-LC3B腺相关病毒感染细胞后，在非自噬的情况下，荧光显微镜下mCherry-GFP-LC3B以弥散的黄色荧光(mCherry和GFP的综合效果)形式存在于细胞质中；而在自噬的情况下，荧光显微镜下mCherry-GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上，以黄色斑点的形式表现出来(LC3B dot or punctae)；当自噬体与溶酶体融合后，因GFP荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。
腺相关病毒感染细胞后通常不会与基因组DNA重组，但可以长期稳定地表达目的蛋白，特别是可以在很多不分裂的细胞中长期稳定表达。AAV还具有滴度高，体内注射不产生明显的免疫反应，对于增殖和非增殖细胞感染效率高等优点。
碧云天的AAV-mCherry-GFP-LC3B是复制缺陷型的，感染普通的细胞后不能进行复制和扩增，必须在辅助病毒存在的情况下才能复制和扩增，从而有效降低了本产品在活体生物中的风险。
腺相关病毒目前发现主要有12种血清型(AAV1-AAV12)，不同血清型AAV有不同的衣壳蛋白，其识别结合的细胞膜表面受体也有所不同，因此不同血清型AAV感染不同类型细胞的感染效率也各不相同。不同血清型AAV的组织亲和性参见下表。
| AAV Serotype | Tissue Tropism | |||||||
| Liver | Muscle | Brain | Retina | Lung | Heart | Pancreas | Kidney | |
| AAV1 | √ | Neuron & glia | √ | √ | √ | |||
| AAV2 | √ | √ | √ | |||||
| AAV3 | √ | √ | √ | |||||
| AAV4 | √ | √ | ||||||
| AAV5 | Neuron & glia | √ | alveolar cells | |||||
| AAV6 | √ | √ | √ | |||||
| AAV7 | √ | Neuron | √ | |||||
| AAV8 | √ | √ | Neuron | √ | √ | |||
| AAV9 | √ | √ | Neuron | √ | √ | √ | √ | √ |
本产品为组织亲和性最为广泛的AAV9血清型，能感染多种组织，使用相对比较广泛。
不同血清型AAV的感染不同种类体外培养细胞的效率参见下表(以AAV2感染效率100%为标准)。参考下表，本产品感染培养细胞的效率很低，不太适合用于感染培养的细胞。
| Cell line | AAV1 | AAV2 | AAV3 | AAV4 | AAV5 | AAV6 | AAV8 | AAV9 |
| Huh-7 | 13 | 100 | 2.5 | 0 | 0.1 | 10 | 0.7 | 0 |
| HEK293 | 25 | 100 | 2.5 | 0.1 | 0.1 | 5 | 0.7 | 0.1 |
| Hela | 3 | 100 | 2 | 0.1 | 6.7 | 1 | 0.2 | 0.1 |
| HepG2 | 3 | 100 | 16.7 | 0.3 | 1.7 | 5 | 0.3 | ND |
| Hep1A | 20 | 100 | 0.2 | 1 | 0.1 | 1 | 0.2 | 0 |
| 911 | 17 | 100 | 11 | 0.2 | 0.1 | 17 | 0.1 | ND |
| CHO | 100 | 100 | 14 | 1.4 | 333 | 50 | 10 | 1 |
| COS | 33 | 100 | 33 | 3.3 | 5 | 14 | 2 | 0.5 |
| MeWo | 10 | 100 | 20 | 0.3 | 6.7 | 10 | 1 | 0.2 |
| NIH3T3 | 10 | 100 | 2.9 | 2.9 | 0.3 | 10 | 0.3 | ND |
| A549 | 14 | 100 | 20 | ND | 0.5 | 10 | 0.5 | 0.1 |
| HT1180 | 20 | 100 | 10 | 0.1 | 0.3 | 33 | 0.5 | 0.1 |
| Monocytes | 1111 | 100 | ND | ND | 125 | 1429 | ND | ND |
| Immature DC | 2500 | 100 | ND | ND | 222 | 2857 | ND | ND |
| Mature DC | 2222 | 100 | ND | ND | 333 | 3333 | ND | ND |
实验室常用的逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒和腺病毒的主要特之间的比较和差别参见下表。具体的特定病毒的一些特征和下表相比可能会有一定差异。
| Retrovirus | Lentivirus | AAV | Adenovirus | |
| Genome | ssRNA(+) | ssRNA(+) | ssDNA | dsDNA |
| Coat | Enveloped | Enveloped | Naked | Naked |
| Particle size | 90-100nm | 90-100nm | 20-30nm | 60-90nm |
| Genome size | 7-10kb | 9kb | 5kb | 38-39kb |
| Genome integration | Yes | Yes | No | No |
| Packaging capacity | 2.5-5kb | 2.5-6kb | 2.5-4.5kb | 3-8kb |
| Infection tropism | Dividing cells | Dividing and non-dividing cells | Dividing and non-dividing cells | Dividing and non-dividing cells |
| Relative Transduction Efficiency | ND | 0.7 | 0.7 | 1 |
| Expression started | 48-72h | 48-72h | 72-96h | 24-48h |
| Expression duration | > 2 months | > 2 months | > 6 months | 3-4 weeks |
| Expression level | Medium | Medium | Medium | High |
| Immune response | Low | Low | Very low | High |
| In vivo safety | Medium | Medium | High | Low |
| Titer before concentration (IFU/ml) | 106 | 107 | 1011 | 107 |
| Titer after concentration (IFU/ml) | ND | 108 | 0.5-1x1013 | 1010 |
| Able to obtain high MOI | No (≤ 10 copies integrated) | No (≤ 10 copies integrated) | Yes | Yes |
| Biosafety level | BSL-2 | BSL-2 | BSL-1 | BSL-2 |
碧云天提供腺病毒和腺相关病毒两种类型的表达mCherry-GFP-LC3B的产品(C3011 AD-mCherry-GFP-LC3B，C3013 AAV-mCherry-GFP-LC3B)。两种产品的比较和选择请参见下表。其中C3013 AAV-mCherry-GFP-LC3B适合用于动物实验， C3011 AD-mCherry-GFP-LC3B更适合于细胞实验，由于表达起始时间短，适合用于能被腺病毒感染并且希望快速获得实验结果的情况。另外，C3011 AD-mCherry-GFP-LC3B可以在表达E1的HEK293A、HEK293等适当细胞中扩增，便于后续长期使用。
| 产品名称 | AD-mCherry-GFP-LC3B | AAV-mCherry-GFP-LC3B |
| 产品编号 | C3011 | C3013 |
| 主要用途 | 细胞实验 | 动物实验 |
| 筛选稳定株 | 不可以 | 不适合 |
| 表达起始时间 | 24-48小时 | 48-72小时 |
| 表达时长 | 3-4周 | 长期 |
| 表达量 | 高 | 中等 |
| 感染细胞类型 | 较多细胞 | 多种组织，不适合细胞株 |
| 可扩增性 | 不可以 | 不可以 |
本产品的滴度为1×1013vp/ml。vp, viral particle，即病毒颗粒。如果用于尾静脉注射8-12周的小鼠，每只小鼠的推荐注射量为2-5×1011vp，此时一个包装的本产品可以用于注射5-12只小鼠。用于小鼠脑内(intracerebal)和心室内(intraventricular)注射的推荐用量是1-5×109vp，用于鼻内(intranasal)注射时的推荐用量为1-3×1010vp，用于眼内(intravitreal)注射时的推荐用量为1-4×109vp。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| C3013-250μl | AAV-mCherry-GFP-LC3B (AAV9, 10^13vp/ml) | 250μl |
| — | 说明书 | 1份 |
-80℃保存，一年有效。-20℃保存，1-2个月内有效。4℃保存，一周内有效。
注意事项：反复冻融会降低病毒滴度，如有必要请在收到本产品后分装保存。分装时必须在冰浴上进行。病毒融解后，如果在一周内使用，可以放置于4℃。如果-80℃保存时间超过一年，可能会导致滴度下降，此时建议重新测定病毒滴度。
本产品对于小鼠等动物在体感染的效率很高，但对大多数常见的体外培养细胞的感染效率很低。因此，本产品适合用于小鼠等动物的体内感染，不太适合用于培养细胞的感染。如果用于培养细胞的自噬研究，推荐选购C3011 AD-mCherry-GFP-LC3B。
如果希望使用本产品之外的其它血清型的AAV-mCherry-GFP-LC3B，可以联系碧云天的技术服务部进行定制。
对于一些比较珍贵的基因敲除或转基因动物或者疾病模型动物，建议先注射1-2个野生型正常小鼠进行预实验，确定注射方式和注射剂量后再开始正式实验。
本产品使用前请仔细阅读附录1《腺相关病毒使用安全规范》。本产品生物安全等级为Biosafety Level 1 (BSL-1)，没有确凿证据显示会导致健康成人产生疾病(Not known to consistently cause diseases in healthy adults)，可以按照常规的微生物实验操作要求进行操作(Standard microbiological practices)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
| BSL | Agents | Practices | Primary Barriers and Safety Equipment | Facilities (Secondary Barriers) |
| 1 | Not known to consistently cause diseases in healthy adults | Standard microbiological practices | ■ No primary barriers required.■ PPE: laboratory coats and gloves; eye, face protection, as needed | Laboratory bench and sink required |
| 2 | ■ Agents associated with human disease■ Routes of transmission include percutaneous injury, ingestion, mucous membrane exposure | BSL-1 practice plus:■ Limited access■ Biohazard warning signs■ “Sharps” precautions■ Biosafety manual defining any needed waste decontamination or medical surveillance policies | Primary barriers:■ BSCs or other physical containment devices used for all manipulations of agents that cause splashes or aerosols of infectious materials■ PPE: Laboratory coats, gloves, face and eye protection, as needed | BSL-1 plus:■ Autoclave available |
| 3 | Indigenous or exotic agents that may cause serious or potentially lethal disease through the inhalation route of exposure | BSL-2 practice plus:■ Controlled access■ Decontamination of all waste | Primary barriers:■ BSCs or other physical containment devices used for all open manipulations of agents■ PPE: Protective laboratory clothing, gloves, face, eye and respiratory protection, as needed | BSL-2 plus:■ Physical separation from access corridors■ Self-closing, double-door access■ Negative airflow into laboratory■ Entry through airlock or anteroom■ Hand washing sink near laboratory exit |
| 4 | ■ Dangerous/exotic agents which post high individual risk of aerosol-transmitted laboratory infections that are frequently fatal, for which there are no vaccines or treatments■ Agents with a close or identical antigenic relationship to an agent requiring BSL-4 until data are available to redesignate the level■ Related agents with unknown risk of transmission | BSL-3 practices plus:■ Clothing change before entering■ Shower on exit■ All material decontaminated on exit from facility | Primary barriers:■ All procedures conducted in Class III BSCs or Class I or II BSCs in combination with full-body, air-supplied, positive pressure suit | BSL-3 plus:■ Separate building or isolated zone■ Dedicated supply and exhaust, vacuum, and decontamination systems■ Other requirements outlined in the text |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| C3006-1ml | Ad-GFP-LC3B | 1ml |
| C3006-10ml | Ad-GFP-LC3B | 10ml |
| C3011-1ml | Ad-mCherry-GFP-LC3B | 1ml |
| C3011-10ml | Ad-mCherry-GFP-LC3B | 10ml |
| C3013-250μl | AAV-mCherry-GFP-LC3B (AAV9, 10^13vp/ml) | 250μl |
| C3015-1ml | Ad-GFP-p62 | 1ml |
| C3015-10ml | Ad-GFP-p62 | 10ml |
| C3016-1ml | Ad- mCherry-p62 | 1ml |
| C3016-10ml | Ad- mCherry-p62 | 10ml |
| D2761-1μg | pCMV-GFP-LC3B | 1μg |
| D2761-100μg | pCMV-GFP-LC3B | 100μ |
| D2762-1μg | pCMV-mCherry-GFP-LC3 | 1μg |
| D2762-100μg | pCMV-mCherry-GFP-LC3 | 100μg |
| D2763-1μg | pCMV-GFP-p62 | 1μg |
| D2763-100μg | pCMV-GFP-p62 | 100μg |
| D2764-1μg | pCMV-mCherry-p62 | 1μg |
| D2764-100μg | pCMV-mCherry-p62 | 100μg |
