碧云天生产的Ki67细胞增殖检测试剂盒(免疫荧光法, 红色, 鼠单抗)，英文名为Ki67 Cell Proliferation Assay Kit (IF, Red, Mouse mAb)，即Ki67 Cell Proliferation Assay Kit (Immunofluorescence, Red, Mouse Monoclonal Antibody)，是通过免疫荧光染色检测细胞增殖标记物Ki67的表达水平以确认细胞是否处于增殖状态的检测试剂盒[1]。本试剂盒中的Ki67鼠单抗可以识别人、小鼠或大鼠的Ki67，因此本试剂盒可以通过荧光显微镜或高内涵筛选(High content screening, HCS)等检测人、小鼠或大鼠等细胞或组织样品中的增殖情况。

本试剂盒提供了固定液、洗涤液、封闭液、一抗、荧光标记二抗、细胞核染色液、封片液，使用时不必再配制其它任何溶液。使用本试剂盒检测HeLa细胞增殖的效果请参考图1。

图1.碧云天Ki67细胞增殖检测试剂盒(免疫荧光法, 红色, 鼠单抗) (C2312S)检测HeLa细胞增殖的效果图。实际染色效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒中提供的封闭液为碧云天的QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)，仅10分钟左右即可完成封闭。

使用本试剂盒染色后Ki67呈红色荧光，其最大激发波长为550nm，最大发射波长为570nm；细胞核呈蓝色荧光，其最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。

Ki67是一种与增殖相关的核蛋白，由MKI-67基因编码，又称为MKI-67。Ki67主要分布在分裂间期的核仁皮层，并在有丝分裂期间被募集到浓缩的染色体中[2,3]，通常只在增殖细胞中表达[4]。其表达在不同的细胞周期阶段有所不同，在G1期至有丝分裂时升高，有丝分裂后立即迅速降低；存在于G1期、S期、G2期和有丝分裂期的细胞核中，而G0期静止细胞的细胞核中不表达[5,6]。因此，Ki67的表达水平可以有效反映细胞的增殖状态。Ki67在癌细胞中高表达，并被认为是肿瘤标志物[7]。在恶性疾病的回顾性研究中，Ki67作为一种潜在的预后标志物被广泛研究。越来越多的临床研究表明，Ki67是一种癌症诊断的重要指标。

本系列产品包括Ki67兔单抗和小鼠单抗两类抗体，同时提供绿色和红色两种荧光二抗，以满足不同的染色和应用需求，具体见相关产品。

如果检测96孔板内的样品，本试剂盒可以检测100-500个样品(抗体重复使用0-4次)；如果用于检测6孔板内的样品，通常可以检测25-50个样品(抗体重复使用4-9次)；如果检测组织切片至少可以检测50个样品。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C2312S-1	固定液	50ml
C2312S-2	洗涤液	250ml×2
C2312S-3	免疫荧光染色封闭液	50ml
C2312S-4	Ki67鼠单抗	5ml
C2312S-5	抗鼠Cy3	5ml
C2312S-6	细胞核染色液(DAPI)	50ml
C2312S-7	抗荧光淬灭封片液	10ml
—	说明书	1份

保存条件：

固定液、细胞核染色液(DAPI) -20ºC保存，其余试剂均4ºC保存，半年有效。其中抗鼠Cy3和细胞核染色液(DAPI)须避光保存。

注意事项：

固定液对人体有害，操作时请特别小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

免疫荧光染色时，请注意回收使用过的Ki67鼠单抗和抗鼠Cy3。回收后通常至少可以重复使用5次，如果出现浑浊、沉淀等异常现象，应停止使用。

每次使用洗涤液洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完时吸尽洗涤液。

需使用可以观察红色荧光和蓝色荧光的荧光显微镜或高内涵分析仪。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.对于贴壁细胞：
a.吸除培养液，用PBS洗涤1次。
b.加入固定液，固定5-15分钟。固定液的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常每孔加入1ml固定液。对于96孔板中的样品，通常每孔加入100μl固定液，其它多孔板的用量可以适当参考执行，后续以6孔板为例进行描述。
c.吸除固定液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
d.加入免疫染色封闭液，室温封闭10-20分钟。免疫染色封闭液的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常加入1ml免疫染色封闭液。
e.吸除免疫染色封闭液，加入Ki67鼠单抗，室温孵育1小时或4ºC孵育过夜。Ki67鼠单抗的用量充分盖住样品即可，对于6孔板或96孔板中的样品，通常分别加入1ml或50μl Ki67鼠单抗。
f.小心吸出Ki67鼠单抗到适当的容器内，4ºC保存，留做下次使用。注：Ki67鼠单抗通常至少可以重复使用5次。
g.洗涤液洗涤3次，每次5-10分钟。
h.加入抗鼠Cy3，室温孵育1小时。抗鼠Cy3的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常加入1ml抗鼠Cy3。
i.小心吸出抗鼠Cy3到适当的容器内，4ºC保存，留做下次使用。注：抗鼠Cy3通常至少可以重复使用5次。
j.洗涤液洗涤2次，每次5-10分钟。
k.加入细胞核染色液(DAPI)，室温染色5分钟左右。细胞核染色液的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常加入1ml细胞核染色液(DAPI)。
l.吸除细胞核染色液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
m.如果是6孔板等较大的孔板，可以滴加适当量的抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片后荧光显微镜下观察。如果是96孔板，通常可以在保留洗涤液的情况下直接进行观察和拍照，或使用高内涵分析仪进行拍照分析。Ki67的染色为红色荧光，细胞核的DAPI染色为蓝色荧光。
2.对于悬浮细胞：
a.离心收集细胞，PBS洗涤1次。吸尽PBS后把细胞适当弹散。
b.加入固定液，轻轻悬浮细胞，固定5-15分钟。
c.离心，去除固定液。
d.加入洗涤液洗涤1次。
e.取少许洗涤液重悬细胞，滴加到盖玻片或载玻片上，做成涂片。充分晾干后继续后续操作。
f.洗涤液洗涤2次，每次5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完毕时吸尽洗涤液。
g.转1.d。后续步骤同1.d起的步骤。或者也可以采用滴染的方法，具体参考如下的步骤。
h.使用免疫组化笔画圈并干燥。免疫组化笔推荐Liquid Blocker Super PAP Pen (免疫组化笔) (P0139)。
i.滴加适量免疫染色封闭液，以充分覆盖样品并且不溢出圈为宜。湿盒内孵育10-20分钟。
j.吸除免疫染色封闭液，滴加适量Ki67鼠单抗，以适当覆盖样品并且不溢出圈为宜，湿盒内室温孵育1小时或4ºC孵育过夜。
k.吸除Ki67鼠单抗，洗涤液洗涤3次，每次用洗涤液孵育5-10分钟。
l.滴加适量抗鼠Cy3，以适当覆盖样品并且不溢出圈为宜，湿盒内室温孵育1小时。
m.吸除抗鼠Cy3，洗涤液洗涤2-3次，每次用洗涤液孵育5-10分钟。
n.滴加适量细胞核染色液(DAPI)，适当覆盖样品并不溢出圈即可，室温孵育5分钟左右。
o.吸除细胞核染色液(DAPI)，洗涤液洗涤3次，每次用洗涤液孵育3-5分钟。
p.滴加适量的抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片后荧光显微镜下观察。Ki67的染色为红色荧光，细胞核的DAPI染色为蓝色荧光。
3.对于组织切片：
a.对于石蜡切片先进行常规的脱蜡和水化处理，对于冷冻切片可以直接进行后续步骤。
b.转1.b。后续步骤同1.b起的步骤。或者也可以采用滴染的方法，具体可以转2.h起的步骤。
参考文献：
1.Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Int J Cancer. 1983. 31(1):13-20.
2.Isola J, Helin H, Kallioniemi OP. Histochem J. 1990. 22(9):498-506.
3.Verheijen R, Kuijpers HJ, Schlingemann RO, et al. J Cell Sci. 1989. 92 ( Pt 1):123-130.
4.Scholzen T, Gerdes J. J Cell Physiol. 2000. 182(3):311-322.
5.du Manoir S, Guillaud P, Camus E, Seigneurin D, Brugal G. Cytometry. 1991. 12(5):455-463.
6.Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker HH, Schwab U, et al. J Immunol. 1984. 133(4):1710-1715.
7.Rioux-Leclercq N, Turlin B, Bansard J, Patard J, Manunta A, et al. Urology. 2000. 55(4):501-505.
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