GreenNuc™活细胞Caspase-3活性检测试剂盒(GreenNuc™ Caspase-3 Assay Kit for Live Cells)是一种使用新型的具有细胞膜通透性的Caspase-3/7绿色荧光底物来检测活细胞中Caspase-3/7活性的试剂盒，可用于实时检测活细胞的凋亡情况。
Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作Caspase 3或caspase 3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase-3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase-3可以剪切procaspase-3、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP (poly (ADP-ribose) polymerase)、ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)、gelsolin和fodrin等。这些由Caspase-3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。另外，Caspase-3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩(chromatin condensation)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。同时Caspase-3对细胞起泡(cell blebbing)也起到关键作用。
本试剂盒的检测原理参见图1。GreenNuc™ Caspase-3 Substrate为耦合DNA绿色荧光染料的多肽DEVD，该底物中的DEVD是caspase 3/7的识别序列，并带有大量负电荷。这些负电荷和DNA带有的负电荷相互排斥，使底物中的DNA绿色荧光染料不能结合DNA，也就不能被激发产生绿色荧光。当最初没有荧光的底物穿过细胞膜进入细胞质，在凋亡细胞中被Caspase-3/7识别并剪切，从而释放出活化的DNA绿色荧光染料分子。当这种DNA绿色荧光染料迁移进入细胞核，并和DNA结合后，就可以被激发而产生明亮的绿色荧光。

图1. GreenNuc™活细胞Caspase-3活性检测试剂盒的检测原理图。

检测试剂直接加入细胞培养液中，孵育15-30分钟后即可直接用于荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测等进行定性或定量检测。本试剂盒同时提供了Caspase-3/7的可逆抑制剂Ac-DEVD-CHO，以方便确认本试剂盒的检测效果。HeLa细胞用本试剂盒检测细胞凋亡的效果参见图2。

图2. HeLa细胞用GreenNuc™活细胞Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡的效果图。未诱导凋亡组观察不到绿色荧光(最左侧一列)；用10μM Camptothecin(喜树碱)孵育过夜诱导细胞凋亡，并加入5μM GreenNuc™ Caspase-3 Substrate孵育30分钟，可以观察到凋亡细胞细胞核处的绿色荧光(中间一列)；而在诱导凋亡的同时加入20μM Caspase-3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO同时孵育，凋亡阳性的绿色荧光细胞数量被显著抑制，说明Caspase-3/7被抑制后，底物不能被剪切，没有活化的DNA绿色荧光染料进入细胞核并染色基因组DNA (最右侧一列)。

本试剂盒检测可以实时检测凋亡情况。传统的Caspase活性检测试剂盒，通常需要裂解细胞或组织样品后进行显色或荧光检测，而不能用于活细胞的Caspase活性检测。通过Western检测Caspase本身的剪切激活，也只能检测样品中的Caspase的平均酶活性。基于荧光标记的Caspase抑制剂的检测技术(fluorochrome-labeled inhibitors of caspases, FLICA)可以进入活细胞检测Caspase活性，但其荧光探针本身就是不可逆的Caspase抑制剂，所以无法在活细胞中实时检测Caspase的活力。本试剂盒中的底物不会抑制细胞的凋亡过程，可以实时监测细胞凋亡的进度。
本试剂盒是双功能的：既可以检测Caspase-3/7的活性，又可以显示细胞核在凋亡过程中的形态学变化。在众多凋亡的细胞内，不同细胞可能处在不同时期并经历着凋亡过程中的不同事件，因而研究中很重要的一点就是能实时独立地跟踪这些事件，从而更好地了解事件之间的相互关系。本试剂盒可以和其它一些荧光探针(如线粒体探针、其它凋亡探针)配合，通过荧光显微镜、流式细胞仪来研究这些不同事件的时间、空间关系。
本试剂盒后续兼容性强：使用本试剂盒检测后，后续可以继续使用多聚甲醛固定，并进行后续的各种免疫染色，包括免疫荧光、免疫组化等。
本试剂盒小包装C1168S如果用于96孔板或流式细胞仪可以进行20-40次检测，96孔板每孔检测体系的体积为100μl时可以检测40次，检测体系体积为200μl时仅可以检测20次；C1168M可检测样品的数量为小包装C1168S的5倍。实际检测次数会因为检测体系和使用的底物浓度而有所不同。
包装清单：

保存条件：
-20℃保存，一年有效。GreenNuc™ Caspase-3 Substrate须-20℃避光保存。
注意事项：
本试剂盒染色兼容多聚甲醛或甲醛固定，但与甲醇固定不兼容。建议用4%多聚甲醛固定10-15分钟，固定后的细胞可以用免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或含有0.1% Triton X-100的适当溶液进行通透处理后进行后续染色。固定或通透等处理时间过长，对本试剂盒染色的亮度会有一定的影响。
荧光染料有一定的淬灭性，请注意避免长时间在荧光显微镜下观察。
本试剂盒组分须尽量避免反复冻融。如果多次使用，请注意适当分装。
Ac-DEVD-CHO在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
有文献报道少数类型的细胞凋亡检测不到Caspase-3/7的激活。
本试剂盒染色后，推荐使用碧云天生产的Hoechst 33342活细胞染色液(100X) (C1027/C1028/C1029)复染，复染后可见所有细胞核呈现明亮的蓝色荧光。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 实验优化：
细胞密度、GreenNuc™ Caspase-3 Substrate浓度、抑制剂浓度、凋亡诱导条件需要提前优化。
a. 细胞密度不宜太少，一般要在50%-90%。
b. GreenNuc™ Caspase-3 Substrate的推荐使用浓度为5μM，最佳浓度可以在1-10μM之间适当摸索。该底物可以直接加在细胞培养液、PBS或其它适当溶液中直接处理细胞。对于贴壁细胞，在加底物前最好更换培养液。底物孵育结束后，培养液可自行选择是否更换。
c. 抑制剂Ac-DEVD-CHO可以抑制Caspase-3/7的活力，由于Ac-DEVD-CHO是可逆的抑制剂，所以抑制剂可以预先加入培养液中处理细胞，室温孵育15-30分钟后再加入底物；也可以在诱导凋亡时就加入抑制剂，添加底物前换液时补加原来浓度的抑制剂。抑制剂的浓度一般是底物的2-4倍。比如用5μM底物时，用10-20μM的抑制剂。有一些细胞需要用非可逆的抑制剂，如Caspase抑制剂Z-DEVD-FMK (C1202)。
d. 各个类型细胞株的凋亡诱导条件请参考文献。
2. 对照
建议设定以下对照：
a. 阴性对照：未诱导凋亡的细胞。
b. 阳性对照：诱导凋亡，未添加抑制剂Ac-DEVD-CHO。
c. 阳性对照：诱导凋亡，并加入抑制剂Ac-DEVD-CHO。本对照用于进一步确认本试剂盒的检测效果。
3. 荧光显微镜检测
a. 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经诱导处理的作为阴性对照。Ac-DEVD-CHO抑制剂组添加一定浓度的抑制剂。
b. 用含5μM底物的新鲜培养液或者PBS对细胞进行换液，Ac-DEVD-CHO抑制剂组要补充原来浓度的抑制剂。
c. 室温避光孵育15-30分钟(如有需要可以孵育更长时间)。
d. 细胞可以在含有底物的培养基中直接观察，也可换液后进行观察。使用观察绿色荧光的滤光片(最大激发/发射波长：500/530nm)。
e. 用Hoechest 33342 (推荐使用碧云天生产的C1027/C1028/C1029 Hoechst 33342活细胞染色液(100X))复染后可见细胞核有蓝色荧光。HeLa细胞用本试剂盒检测细胞凋亡的效果参见图2。
4. 流式细胞仪检测
a. 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经诱导处理的作为阴性对照。抑制剂组添加一定浓度的抑制剂。
b. 贴壁细胞，先用胰酶或者其它方法消化细胞。用培养液或者缓冲液重悬细胞，使细胞浓度在10⁶/ml。
c. 吸取200μl至流式检测管，加入1μl的底物，立即混匀使底物终浓度为5μM。不同的细胞合适的底物浓度不同，需要自行进行优化。
d. 室温避光孵育15-30分钟(如有需要可以孵育更长时间)。
e. 加入300μl培养基或者适当溶液，流式细胞仪分析。检测绿色荧光通道(最大激发/发射波长：500/530nm)。
5. 酶标仪检测
a. 贴壁细胞生长在黑色96孔板中；对于悬浮细胞，将密度调整至10⁶细胞/ml，0.2ml细胞悬液/孔。
b. 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经诱导处理的作为阴性对照。抑制剂组添加一定浓度的抑制剂。
c. 贴壁细胞用含5μM底物的新鲜培养液或者PBS对细胞进行换液，Ac-DEVD-CHO抑制剂组要补充原来浓度的抑制剂。如果是悬浮细胞，就直接加入底物或抑制剂。
d. 室温避光孵育15-30分钟(如有需要可以孵育更长时间)。
e. 对于悬浮细胞，轻轻摇晃重悬细胞。酶标仪设置激发波长485nm，发射波长515nm。贴壁细胞建议使用底读的方式。细胞密度的变化可能导致不准确的读数。
6. 细胞核的染色：
如果有必要，细胞可以用Hoechst 33342染料染细胞核，此时细胞核为蓝色荧光(激发/发射波长：346/460nm)。
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