增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)
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产品编号 C0905-1L
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¥ 499.00
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500ml 1L
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碧云天生产的增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺),即Enhanced 293 Serum-free Culture Medium (with L-Glutamine),简称Enhanced 293 SFM,是一种化学成分确定的、无血清、无蛋白质或生长因子、不含任何动物源性物质(Animal origin-free, AOF)的,专门用于各种亚型或衍生HEK293细胞的高密度悬浮培养和高效率瞬时转染表达的即用型液体培养液。本增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)可用于培养的293细胞包括293S、293F等悬浮细胞,以及被驯化过的293H、293E、293T等[1-3],特别适用于在普通293无血清培养液效果不佳或瞬转导致细胞大量死亡等情况下的替换。

293无血清培养液也被称为CD (Chemical-defined) 293培养液、CD 293 Medium、CD 293 Cell Culture Medium、CD 293细胞培养液、293 SFM (Serum-free Medium)、293 Expression Medium、293表达培养液等。培养液、细胞培养液、基础培养液、无血清培养液也分别称为培养基、细胞培养基、基础培养基、无血清培养基。HEK293即Human Embryonic Kidney 293,简称293,来源于人胚肾细胞[4]。

本产品经过过滤除菌处理,可以直接用于293等细胞的无血清培养,含L-谷氨酰胺(L-Glutamine),浓度约为4mM,一般无需额外添加L-谷氨酰胺,也无须添加血清、抗生素、非离子表面活性剂物质(如F-68)以及抗结团试剂等。

成分说明:本增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)的化学成分确定,含D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、酚红等组分;不含动物源性物质、血清、蛋白质、水解物和生长因子。超纯水配制,黄红色透明液体,pH为7.0-7.4,渗透压为255-300 mOsm/kg,内毒素低于1EU/ml。

产品特征:293细胞常用含血清的培养液进行贴壁培养。与悬浮培养相比,贴壁培养较为费力且成本更高,且蛋白质和血清的存在不仅会成为实验和数据分析中的混杂因素,影响重复性,还可能干扰下游纯化、影响产物质量。增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)支持各种亚型和衍生的293细胞的悬浮培养,细胞通常无需任何适应,即可进行高密度培养,有助于提升细胞的活性,以最大限度地生产重组病毒或重组蛋白[1-3]。此外,本产品化学成分明确,不含未知组分,不含蛋白质,也无需额外添加血清,尽可能地减少了外源性物质的引入,批次间稳定性好,有效简化了目标产物的下游纯化,提高了实验或生产的重复性。

瞬转后的细胞活率高,瞬转效率佳:阳离子聚合物等转染试剂具有微量的细胞毒性,通常会不同程度影响转染效果。使用本产品可维持细胞处于更好的状态和更高的活率,转染后,活细胞密度和活率受到更小的影响,目标产物的产量可达最佳。

用途:增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)可以支持各种293悬浮细胞如293S、293F等的高密度培养和高效率瞬时转染表达,广泛应用于糖基化重组蛋白和抗体的高产量制备生产、外泌体膜上蛋白的融合表达、病毒高效包装等。增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)也可以用于被驯化过的其它293细胞、亚型或衍生的细胞系,如驯化过的293H、293E、293T等293细胞。使用本产品培养HEK293细胞的活细胞密度和活率效果参考图1。

图1. 碧云天增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺) (C0905)培养HEK293细胞的活细胞密度和活率图。如图所示,接种同样密度的HEK293细胞,相较于普通的293无血清培养液(含L-谷氨酰胺) (C0901) (293 SFM),使用增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺) (Enhanced 293 SFM)培养7天的HEK293细胞活细胞密度和存活率更高。VCD, Viable cell density。实际检测效果会因检测仪器、实验条件的不同而存在差异,本图仅供参考。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
C0905-500ml 增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺) 500ml
C0905-1L 增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺) 1L
说明书 1份
保存条件:

4ºC避光保存,一年有效。

注意事项:

本产品4ºC保存时应避免靠近冰箱壁,以免局部温度过低导致沉淀析出。如果有沉淀析出,室温摇晃片刻,再放置在4ºC冰箱过夜或更长时间,待沉淀消失后再使用。

本产品一般适用于293细胞悬浮培养,不推荐用于没有经驯化过的贴壁293细胞的培养。

使用本产品应注意无菌操作,避免污染。一般不建议补充抗生素,以免影响细胞的正常生长速度,但如果不能在高洁净度细胞培养室内操作,仍需加入适量的抗生素。

若使用过程中发现培养液浑浊、沉淀等异常现象,则不能继续使用。

本产品中已添加的L-谷氨酰胺(约4mM)是细胞培养所必需的营养成分,一般无需额外再添加,否则可能产生细胞毒性。但L-谷氨酰胺在溶液中不太稳定、易分解,若本培养液长期放置后再使用,发现细胞生长变慢,可在使用前加入适量的L-Glutamine (100X) (C0212)或可以稳定保存的L-Ala-Gln (100X) (C0211),以维持细胞的正常生长代谢。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 293悬浮细胞的复苏。
a. 将细胞冻存管从液氮或超低温冰箱中取出,并在37ºC水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染),并适当轻轻摇晃促融,切勿vortex。快速、完全融化可以提高细胞的复苏效果。
b. 打开冻存管前用70%酒精擦拭细胞冻存管外壁,注意某些记号笔不耐酒精,小心标注的记号被擦拭掉,推荐使用碧云天LAB MARKER (耐酒精记号笔, 黑色, 0.4/1.0mm) (FPP21)。
c. 将完全融化的细胞直接离心,或者转移至无菌1.5ml或其它合适无菌离心管中,200×g室温离心5分钟,吸除上清,注意不要吸走细胞沉淀。
d. 用新鲜、预热至37ºC的增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)重悬后转移至培养容器中,推荐碧云天的BeyoGold™透气盖三角摇瓶系列产品,混匀,置于37ºC、5-8% CO2、湿度80%的细胞培养摇床中培养,设置转速为130rpm (振幅26mm)。注:如摇床振幅为50mm,设置转速为120rpm。
2. 293悬浮细胞的传代。
a. 取处于对数生长期、细胞存活率大于95%、活细胞密度达到2-4×106个/ml以上的293细胞进行传代。
注1:不同类型的293细胞可能具有不同的对数生长期范围。
注2:在细胞传代30次或者持续3个月以上时,推荐复苏新的冻存细胞进行传代。
注3:推荐使用碧云天生产的台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(C0011)或细胞计数仪进行细胞存活率检测。
b. 将适量细胞悬液转移到无菌离心管内,200×g室温离心5分钟,弃去上清,加入适量预热的增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺),用吸管小心吹散沉淀细胞,获取细胞悬液。
c. 将细胞悬液以3×105-6×105个/ml的密度接种到新的培养容器中,培养条件与细胞复苏培养条件保持一致。
注1:每2-3天用增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)按上述步骤进行传代。
注2:为减少液体摇动产生的机械剪切力对细胞的损伤,装载大体积三角细胞摇瓶的摇床转速应适当调低。
注3:293悬浮细胞可能形成由2-10个细胞组成的细胞团,传代时可能需要剧烈涡旋细胞悬液40秒或适当时间,直到细胞团分散为单细胞悬液。
注4:请勿使用过高密度的细胞进行常规传代培养。
3. 293悬浮细胞的驯化。
a. 直接驯化法:
大部分情况下,培养于其它品牌无血清培养液中的293细胞,可以直接适应本增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)的培养,只需参照步骤2进行细胞传代即可。
b. 梯度驯化法:
梯度驯化法又称渐进式驯化或适应性驯化。由于增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)为化学成分限定培养液,有些293细胞需要进行梯度驯化,即在一段时间内用本增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)和原培养液的混合液培养细胞,培养过程中需逐渐降低原培养液占比、提升增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)占比。
(a) 用原培养液复苏293细胞,并使用该培养液继续培养2-3代直至293悬浮细胞稳定生长。
注:应选用低代数、处于对数生长期的细胞进行驯化。
(b) 参照下表对细胞进行梯度驯化。
增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)占比(%) 原培养液占比(%) 细胞接种密度(个/ml) 细胞生长状态检测指标 进行下一阶段的标准
0 100% - VCD* & Cell viability VCD ≥ 3×106 cells/ml;
Cell viability ≥ 95%
30% 70% 0.6×106 VCD & Cell viability VCD ≥ 2×106 cells/ml;
Cell viability ≥ 90%
70% 30% 0.5×106 VCD & Cell viability VCD ≥ 2×106 cells/ml;
Cell viability≥ 90%
100% 0% 0.4×106 VCD & Cell viability VCD ≥ 2×106 cells/ml;
Cell viability ≥ 90%
* VCD, Viable cell density.
注1:每阶段应至少传代2次。
注2:在完全使用增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)接种3-4天之后,若VCD ≥ 3×106 cells/ml,Cell viability≥95%,则表明细胞生长、状态良好,该细胞已经完全驯化至适应增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)。
4. 293悬浮细胞的冻存。
a. 细胞的准备:使用对数生长期且细胞活率大于95%的细胞用于冻存。
注:须保存适量的已经培养过的培养液上清即条件培养液(Conditioned media)用于细胞冻存液的配制。
b. 进行细胞计数,确定活细胞密度,并计算活细胞密度为0.5-1×107个/ml时所需细胞冻存液的体积。
c. 细胞冻存液的配制:45%新鲜的增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)+45%条件培养液+10% DMSO,并在4ºC避光条件下预冷。配制的细胞冻存液须当天使用。为方便起见,推荐使用碧云天的BeyoAOF™无血清细胞冻存液(C0210B),可以直接使用无须进行配制。
d. 将细胞室温200×g离心5分钟,除去上清,用预冷的细胞冻存液将离心收集的细胞重悬。
e. 后续操作和普通细胞冻存一致,具体参考BeyoAOF™无血清细胞冻存液(C0210B)中的使用说明。
注:建议细胞冻存24小时之后,或者长期冻存(例如半年或一年后),进行细胞复苏,检测细胞复苏的效果。
5. 293悬浮细胞的瞬时转染。
a. 下表转染条件仅供参考,用户可根据实验的具体情况进行优化。此处以瞬时转染1L 293悬浮细胞为例:
Items Value
VCD 2-4×106 cells/ml
DNA 0.7-2μg/ml
DNA/PEI ratio 1:2~1:6
注:推荐使用碧云天专门适用于悬浮293细胞转染的Lipo293F™转染试剂(C0518/C0519)或线性聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, Linear) (C0537/C0541),使用方法也同样可以参考。
b. 取处于对数生长期、细胞存活率>95%、活细胞密度为2-4×106个/ml的293悬浮细胞进行转染。
c. 用10ml增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)稀释0.7-2mg质粒DNA,轻轻混匀。
d. 用10ml增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)稀释适量PEI,轻轻混匀。
e. 将PEI稀释液加到质粒DNA稀释液中,轻轻颠倒4-5次以充分混匀,室温孵育15-20分钟。
注:PEI稀释液与质粒DNA稀释液的混合顺序不可颠倒。
f. 将混合物逐滴加入细胞中,在加入过程中轻轻摇动三角细胞摇瓶。
g. 将细胞置于细胞培养摇床中培养,培养条件与细胞正常培养条件保持一致。
h. 一般本增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)可维持48-72小时的培养时间,无须添加补料;也可以在转染后每隔24小时向细胞中添加一定量的补料,在加入过程中轻轻摇动培养容器。随后将细胞放回细胞培养摇床中继续培养。
i. 当细胞存活率<80%时收集细胞上清液或细胞进行后续纯化。
参考文献:
1. Schneider MD, French BA. Circulation. 1993. 88(4 Pt 1):1937-42.
2. Fisher KJ, Jooss K, Alston J, Yang Y, Haecker SE, et al. Nat Med. 1997. 3(3):306-12.
3. Yan SB, Chao YB, van Halbeek H. Glycobiology. 1993. 3(6):597-608.
4. Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. J Gen Virol. 1977. 36(1):59-74.
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