碧云天研发的3D细胞培养包被试剂盒(U形底96孔板) (3D Cell Culture Coating Kit for 96-Well Plate with Round Bottom)，是一款便捷、高效的用于制备细胞3D培养用U形底96孔板，以支持细胞球体持续形成和培养的试剂盒。本试剂盒特别适用于提供细胞3D生长微环境，使各种细胞从单细胞悬液培养成细胞球，包括肿瘤球体(Spheroid)、肿瘤类器官(Organoid)、神经细胞球(Neurosphere)、白细胞球等。使用本产品包被的细胞培养板可生成大小比较均一的细胞球体，广泛应用于肿瘤研究、药物筛选、类器官构建及组织工程等领域。

本试剂盒提供3D细胞培养包被液和U形底96孔板用于细胞3D培养环境的构建。3D细胞培养包被液的主要成分是一种特殊的高分子多聚物，可作为非粘附性基质包覆容器，快速在容器表面形成一层亲水涂层，以抑制细胞粘附到容器的生长表面。本产品搭配使用96孔等细胞培养板，即可实现一致的、可重复的细胞3D生长，显著降低差异性。本产品包被细胞培养板的操作简单、易于上手，后续细胞培养的实验操作流程和传统的细胞培养实验基本相同。

传统的细胞培养大多以二维(Two-dimensional, 2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低[1-3]。三维(Three-dimensional, 3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反应细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果[4-5]。

3D肿瘤细胞模型越来越多地被用于了解疾病机制和药物研发。2D培养的肿瘤细胞，其单侧细胞膜可以均匀地获得营养和氧气，而3D培养的肿瘤细胞团的内部细胞获得营养和氧气的机会更少，形成自然的营养和氧气梯度，能更好地模拟体内微环境条件，因此3D培养的肿瘤球状体(Spheroid)或肿瘤类器官(Organoid)等能更好地模拟体内肿瘤，更利于小分子药物筛选或者肿瘤相关分子机制的研究，也更能准确地预测药物治疗的体内反应、疗效或毒性。同时，2D肿瘤细胞模型体外扩增有一定局限性，在传代后容易丧失原肿瘤的遗传异质性，出现优势克隆选择性，从而降低临床相关性。相比于2D细胞模型，3D细胞球或者类器官很多情况下下能提供更可信的研究结果，简化并加速药物评价流程。自2009年小肠类器官首次建立至今，3D细胞和类器官研究已经扩展到很多组织系统，并成为生命科学最热门的领域之一。

本试剂盒操作简单、便捷。本试剂盒包含高品质可用于细胞培养的无菌BeyoGold™ 96孔培养板(圆底带盖, 表面未处理, 独立包装)，简称U形底96孔板，单独货号为FPT017，仅需1步即可完成3D细胞培养环境构建，即用3D细胞培养包被液对U形底96孔板进行包被，整个包被过程最少仅需约30分钟。包被后，按照常规的细胞培养方法接种和培养细胞，一般继续培养24-48小时即可获得相对较为紧密的细胞球，不同类型的细胞培养板细胞球的形成时间可能会有差别。细胞球体的大小可以通过细胞的初始接种密度来控制。

本试剂盒应用广泛，适用于大量常见细胞的3D培养，并且培养速度快。本试剂盒支持不同的细胞类型，不仅可用于HCT-116、HeLa等贴壁细胞的3D培养，也可用于K562、MOLM-13等悬浮细胞的3D培养。细胞接种于本试剂盒包被的U形底96孔板2小时就可以呈现出明显的聚集状态，随着培养时间的延长球体会越来越紧密。培养至48小时后，可形成一个比较紧实的细胞球，球体大小和接种的细胞数目成正比。而相较于U形底部结构，平底多孔板或培养皿一般需要3-5天以上才能培养成细胞球。本试剂盒对HCT-116细胞成球培养效果参考图1。

图1.碧云天3D细胞培养包被试剂盒(U形底96孔板) (C0366)对HCT-116细胞成球培养效果图。图中培养时间较短时，细胞相对比较分散。随着培养时间延长，细胞会形成比较紧实的球状，看起来占的投影面积会变小。实测效果会因细胞种类、细胞数目、细胞培养时间等的不同而有所不同，上图仅供参考。

本试剂盒小包装提供20ml 3D细胞培养包被液和5个U形底96孔板。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C0366S-1	3D细胞培养包被液	20ml
C0366S-2	BeyoGold™ 96孔培养板(圆底带盖, 表面未处理, 独立包装)	5个
—	说明书	1份

保存条件：

4ºC保存，一年有效。室温保存，半年有效。3D细胞培养包被液-20ºC可以保存更长时间。U形底96孔板室温保存，三年有效。

注意事项：

3D细胞培养包被液如果是-20ºC保存，使用前须回复至室温。

3D细胞培养包被液含有一定浓度的乙醇，易挥发，在使用和储存过程中须密封。

3D细胞培养包被液加入U形底96孔板时应尽量避免出现气泡，如果不小心出现气泡，需要用枪头小心将气泡挑破，否则可能会影响U形底96孔板的包被效果，进而影响细胞的培养效果。

即时包被时，包被液加入培养板及吸去后的静置时间都必须长于10分钟，并尽量延长时间为佳， 否则可能会影响培养效果。

3D细胞的成球速度、球体紧密度、以及球体的形态等和细胞种类、细胞数量密切相关，不同的细胞种类和细胞数量，3D细胞的成球速度及细胞球的状态可能会有较大的差别。

尽管本产品可以即时包被使用，但如果要获得更好的培养效果，建议提前包被并在干燥箱或烘箱中烘干液体，使用效果更好。烘干后的培养板如果不能立刻使用，应及时密封后存放在4ºC，3个月内有效；如果存放于室温，一周内有效；如果37ºC存放，一天内有效。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.U形底96孔板的包被：
a.U形底96孔板的即时包被。
(a)在超净工作台或生物安全柜内，向U形底96孔板每孔加入40μl包被液。注：加液时需避免出现气泡。
(b)盖上U形底96孔板盖子，放入二氧化碳培养箱静置至少10分钟。注：延长静置时间，效果会更佳。
(c)取出培养板，小心吸去包被液，避免触及底部包被区。
(d)培养板在超净工作台内继续静置干燥至少10分钟，然后进行细胞接种。注：延长静置干燥时间，效果会更佳。
b.U形底96孔板的提前包被。
(a)在超净工作台或生物安全柜内，向U形底96孔板每孔加入包被液40μl。注：加液时避免出现气泡。
(b)盖上U形底96孔板盖子，放入37ºC干燥箱或烘箱过夜，直至孔板中的液体完全挥发。注：培养板在37ºC干燥箱或烘箱中的干燥时间最好不要超过2天。请注意挥发出的主要是水和乙醇，须避免水和乙醇影响其它样品。
(c)取出培养板，进行细胞接种；如果培养板暂时不使用，可以放入自封袋或保鲜袋中密封后存放于4ºC，通常3个月内有效。
2.细胞的3D培养：
a.包被好的U形底96孔板，每孔接种100μl细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如细胞种类、细胞密度、培养天数、需要的3D细胞球体的大小等确定。
b.细胞通常在接种2小时就呈现明显的聚集状态，培养24至48小时逐渐形成细胞球。注：具体的成球速度、球体紧密度、以及球体的形态等和细胞种类有关。
c.球体形成后，可以使用适宜量程的移液器轻缓换液，保证细胞球的完整；也可以在孔板中吸出约一半体积的培养液，再加入与吸出体积等量新鲜的培养液，即采用半换液的形式，以免将细胞球吸走。
d.根据实验需求，可以使用Cell Counting Kit-3D (CCK-3D试剂盒) (C0049)或CellTiter-Lumi™发光法3D细胞活力检测试剂盒(C0061/C0062)检测细胞球的总体细胞活力，或者使用1ml的枪头吸取细胞球至离心管中，静置待细胞球沉降以后，移除上清，进行后续实验。
注1：细胞球尺寸为几十至数百微米，肉眼观察通常为针尖大小、乳白色。
注2：操作时尽量轻缓，以避免细胞球损伤或丢失。
注3：需确认细胞成球紧实后再进行后续实验。
参考文献：
1.Kapałczyńska M, Kolenda T, Przybyła W, Zajączkowska M, Teresiak A, et al. Arch Med Sci. 2018. 14(4):910-919.
2.Riedl A, Schlederer M, Pudelko K, Stadler M, Walter S, et al. J Cell Sci. 2017. 130(1):203-218.
3.Hoarau-Véchot J, Rafii A, Touboul C, Pasquier J. Int J Mol Sci. 2018. 19(1):181.
4.Ravi M, Paramesh V, Kaviya SR, Anuradha E, Solomon FD. J Cell Physiol. 2015. 230(1):16-26.
5.Antoni D, Burckel H, Josset E, Noel G. Int J Mol Sci. 2015. 16(3):5517-27.
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