碧云天生产的BeyoDirect™支原体qPCR检测试剂盒(BeyoDirect™ Mycoplasma qPCR Detection Kit)，是一种无须提取样品中DNA或RNA，可以直接使用细胞培养液或血清等样品，通过探针法qPCR (Quantitative PCR)高灵敏检测培养的细胞等生物材料中是否有支原体污染的试剂盒。本试剂盒可快速、有效、高灵敏地检测支原体污染。

支原体(Mycoplasma)是最小、最简单的原核生物。支原体有如下特征：支原体无细胞壁结构，所以针对细胞壁的许多常见的抗生素，如青霉素或β-内酰胺类抗生素对支原体无效；支原体大小介于细菌和病毒之间，约为0.2-0.8μm，所以部分支原体可通过0.22μm滤器，常规的过滤对支原体无效；很多支原体由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供营养，所以通常吸附或散落在细胞表面和细胞之间。支原体的这些特征使细胞培养过程中存在支原体污染的风险，细胞的支原体污染已经成为一个世界性的普遍问题[1]。

支原体污染可能会严重影响细胞的状态，使细胞的基因表达、代谢特征发生变化，导致细胞生长减缓、分化和死亡异常，严重影响细胞功能。这些影响因素会严重影响实验结果的可靠性、可重复性和一致性，因此支原体污染的检测非常重要。

细胞培养过程中的细菌、酵母或霉菌污染在光学显微镜下可见，但支原体污染在光学显微镜下通常不可见，必须通过特定的检测方法进行检测。检测支原体污染的常用方法有支原体分离培养、ELISA、发光法等特殊的生化检测以及DNA荧光染色检测等。上述检测方法中，大多操作步骤相对比较烦琐、灵敏性不高或所需时间较长。而qPCR法操作方便简单，PCR扩增后无需电泳分析即可确定是否有支原体污染。

本试剂盒根据支原体基因组中保守的23S rRNA操纵子编码区序列[2]，设计特异性引物和荧光探针(FAM标记)，可直接以细胞培养液上清或血清等生物材料为模板进行检测。本试剂盒可以扩增和检测39种支原体。本试剂盒特异性扩增支原体DNA，对细菌、真菌、真核细胞DNA不扩增。

本试剂盒提供了qPCR实验所需的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、引物、探针、PCR Buffer、dNTPs、稳定剂、Nuclease-free Water和镁离子等所有的通用组分。本试剂盒还包含Internal Control DNA (VIC标记)，即内对照DNA，用于添加到每个PCR反应中，检测是否有抑制PCR反应物质。此外，本试剂盒提供Positive Control，即阳性对照，可用于检测试剂盒本身是否能正常工作。

图1. 碧云天支原体qPCR检测试剂盒(C0303)用于阳性对照和阴性对照的检测效果图。左图是试剂盒中的阳性对照，右图是试剂盒中的Nuclease-free water作为阴性对照，两组对照同时添加了内参对照DNA，FAM为支原体检测信号，VIC为内参对照检测信号。左图的支原体和内对照检测曲线正常，而右图仅内参对照检测曲线正常，支原体为阴性。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒适用于具有FAM和VIC检测通道的荧光定量PCR仪，如ABI的7500、7900、StepOne、QuantStudio系列，Roche的LightCycler480、SmartCycler，Bio-Rad的CFX96、Chromo4、Opticon 2、iCycler IQ、iQ5，Qiagen的Rotor Gene 6000，上海宏石SLAN-96P等。

本试剂盒进行了相关优化，可直接检测含支原体的细胞培养液上清、血清等样品，无须单独提取DNA。本试剂盒所用检测方法非常灵敏，通过阳性对照计算出的检测下限约为2-20 copies/μl。

如果发现有支原体污染，优先建议更换无污染的细胞进行培养。如果有必要预防或去除支原体，可使用专用的支原体预防或去除试剂，如支原体清除试剂(C0288)、支原体清除试剂Plus (C0290)、支原体预防去除试剂I (C0292)、支原体预防去除试剂II (C0293)、Myco-Zero™支原体去除试剂(C0280)、Myco-Zero™ Plus支原体去除试剂(C0285)。

本产品如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl)，本产品小包装分别可以进行100次和200次检测，中包装分别可进行500次和1000次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C0303S-1	BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)	1ml
C0303S-2	Primer Probe Mix	200μl
C0303S-3	Internal Control DNA	100μl
C0303S-4	Positive Control	200μl
C0303S-5	Nuclease-free Water	1ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
C0303M-1	BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)	5ml
C0303M-2	Primer Probe Mix	1ml
C0303M-3	Internal Control DNA	500μl
C0303M-4	Positive Control	1ml
C0303M-5	Nuclease-free Water	5ml
－	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存，一年有效。其中BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)和Primer Probe Mix需要-20℃避光保存。尽量避免反复冻融。

注意事项：

使用前需确保试剂完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。

BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)和Primer Probe Mix中含有荧光染料，保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。

经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响，但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。请勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖，PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

本试剂盒可以检测出细胞污染的常见支原体种类，对于少数怀疑可能有不能鉴定的支原体种类污染的比较重要的细胞，推荐使用碧云天Myco-Lumi™发光法支原体检测试剂盒(C0297/C0298)进行双重检测。严格的支原体检测，需使用两种以上不同原理的方法同时检测，才能最有效的避免假阳性和假阴性。

建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系，这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。推荐BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(FTIP631/FTIP635/FTIP638)

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.需要用户自备的耗材、仪器和试剂：
a.具有FAM和VIC/HEX/JOE荧光通道的荧光定量PCR仪。
b.DNase-free、RNase-free的吸头、离心管、荧光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜。
2.样本准备：
可用于检测支原体污染的样品：细胞接种后培养了3-6天的培养上清液、细胞培养液、血清。如使用细胞悬液做样品，则需要提取DNA后再进行PCR。注1：青霉素和链霉素对PCR反应无抑制作用。注2：样品加入量一般为反应体系1/10的量或更少。如果样品不能及时检测，可以置于-20℃或者-80℃保存。
3.qPCR反应体系的设置：
a.融解并混匀反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。
b.参考下表在室温或冰浴上设置qPCR反应体系(以96孔板，每孔反应体系为20µl为例)。下表中的Template为样品、阴性对照(Negative Control)或阳性对照(Positive Control)。Negative Control可使用Nuclease-free Water。建议每次检测都设置Negative control和Positive control。如果确定没有抑制PCR反应的物质，可以不添加Internal Control DNA。

Reagent	Volume
BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)	10μl
Primer Probe Mix	2μl
Template	2μl
Internal Control DNA	1μl
Nuclease-free Water	5μl
Total Volume	20μl

c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
d.将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。
e.荧光检测通道的选择：Internal Control DNA探针的荧光基团是VIC，可选择检测通道(Reporter)为VIC/HEX/JOE，淬灭基团(Quencher)是BHQ1，如果没有BHQ1，则选择无；支原体探针的荧光基团是FAM，可选择检测通道为FAM，淬灭基团是BHQ3，如果没有BHQ3，则选择无。请将仪器的荧光内参设置为“None”，例如：对于ABI系列仪器，将“Passive Reference”设置为“None”。
4.qPCR反应程序：
本试剂盒建议采用如下的qPCR程序，本程序是以QuantStudio™ 6 Flex Systems荧光定量PCR仪为例：
a.预变性：95℃ 2min
b.变性：95℃ 15sec
c.退火/延伸：60℃ 20sec
d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环
e.最后使用荧光定量PCR仪提供的软件分析检测结果
5.结果的定性判断：
a.阳性对照：FAM通道和VIC通道呈典型S型扩增曲线且Ct值≤33。
b.阴性对照：FAM通道无典型S型扩增曲线或Ct值>35，VIC通道呈典型S型扩增曲线且Ct值≤33。
c.样品阳性：如果待测样本检测结果FAM通道和VIC通道均呈典型S型扩增曲线且Ct值≤33，且阳性对照品检测结果为阳性，阴性对照品检测结果为阴性，此次结果判断为支原体阳性。
d.样品阴性：如果待测样本检测结果FAM通道无典型S型扩增曲线或Ct值>35，VIC通道呈典型S型扩增曲线且Ct值≤33，且阳性对照品检测结果为阳性，阴性对照品检测结果为阴性，此次结果判断为支原体阴性。
e.可疑：如果FAM通道33<Ct值≤35，则此样本应培养2-3天后重新取样后再次进行检测。
f.出现PCR抑制现象的，可以适当稀释或用核酸抽提试剂盒，提取DNA后再做PCR鉴定。

支原体探针(FAM标记)	内对照探针(VIC标记)	结果判断
典型S型扩增曲线且Ct值≤33	典型S型扩增曲线且Ct值≤33	阳性
无典型S型扩增曲线或Ct值>35	典型S型扩增曲线且Ct值≤33	阴性
无典型S型扩增曲线或Ct值>35	无典型S型扩增曲线或Ct值>35	PCR抑制

参考文献：
1.Rawadi G, Dussurget O. Prokaryotes. 1995. 20: 20.
2.Ishikawa, Y., Kozakai, T., Morita, H. et al. Dev.Biol.-Animal 2006. 42, 63–69.
附录：
本试剂盒可以扩增的支原体种类：

种属	种属	种属
Mycoplasma agalactiae	Mycoplasma cloacale	Mycoplasma hominis
Mycoplasma alkalescens	Mycoplasma columbinasale	Mycoplasma hyopharyngis
Mycoplasma anseris	Mycoplasma columbinum	Mycoplasma hyopneumoniae
Mycoplasma arginini	Mycoplasma conjunctivae	Mycoplasma hyorhinis
Mycoplasma arthritidis	Mycoplasma cynos	Mycoplasma lagogenitalium
Mycoplasma bovigenitalium	Mycoplasma dispar	Mycoplasma leachii
Mycoplasma bovirhinis	Mycoplasma edwardii	Mycoplasma maculosum
Mycoplasma bovis	Mycoplasma fermentans	Mycoplasma mycoides
Mycoplasma bovoculi	Mycoplasma flocculare	Mycoplasma neurolyticum
Mycoplasma californicum	Mycoplasma gallinaceum	Mycoplasma orale
Mycoplasma canadense	Mycoplasma gallinarum	Mycoplasma ovipneumoniae
Mycoplasma capricolum	Mycoplasma gallopavonis	Mycoplasma salivarium
Mycoplasma citelli	Mycoplasma glycophilum	Mycoplasma synoviae

注：黑标的为细胞培养过程中最常见的种类。
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