来源	用途	交叉反应性	理论分子量	实际分子量
Rabbit	IHC	Human	72kDa	-

IHC-P, Immunohistochemistry-paraffin; IHC-Fr, Immunohistochemistry-frozen; IF, Immunofluorescence;

ICC, Immunocytochemistry; WB, Western blot; FC, Flow Cytometry.

建议抗体使用时的稀释比例如下(实际使用时需根据抗原水平的高低作适当调整)：

IHC-P	IHC-Fr	IF/ICC	WB	FC
1:100-1:200	N/D (not determined)	N/D	N/D	N/D

BeyoIHC™系列抗体是经过测试适用于免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)的高品质抗体，也称病理抗体，很大一部分为重组兔单克隆抗体(Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody)，通过先进的兔单克隆抗体技术平台研发并生产，无需获取动物的脾脏，仅需分离抗原特异性B细胞并通过基因工程方法克隆抗体基因，然后在哺乳动物细胞中重组表达并最终纯化获得[1-2]。

BeyoIHC™抗体灵敏度更高，背景更低，染色更清晰，定位更精准。BeyoIHC™系列抗体通过反复的筛选和测试，确保灵敏度高、背景低、染色效果好[3]。

BeyoIHC™抗体特异性更强，染色结果更为准确。BeyoIHC™系列抗体大部分都是精心筛选的高效价单克隆抗体，是由单个B细胞淋巴瘤表达，只针对一个抗原表位发生特定的免疫反应，应用于免疫组化时特异性更强，染色结果更为准确[3]。

BeyoIHC™抗体一致性更好，批次间差异更小，结果重复性更好。BeyoIHC™系列抗体很大一部分是重组抗体，具有确定的抗体序列，使用不含任何动物源性物质培养液的哺乳细胞表达体系，生产的可重复性、一致性高，批次间差异小，可避免杂交瘤细胞制备过程中的基因丢失、基因突变和细胞株漂移等问题，所制备的重组抗体的重复性更好[3]。

BeyoIHC™系列抗体主要用于福尔马林固定石蜡包埋(Formalin fixed paraffin embedded, FFPE)样品的免疫组织化学染色(Immunohistochemistry-paraffin or Immunohistochemistry paraffin-embedded, IHC-P)。对于冰冻切片免疫组织化学(Immunohistochemistry frozen sections, IHC-Fr)、细胞免疫荧光(Immunofluorescence, IF)或免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)未经测试(Not determined)。同时，BeyoIHC™系列抗体可识别人的相应蛋白，对于小鼠等其它种属很大一部分未经测试。对于未经测试的应用及种属样品，理论上有可能是可以检测的，但须用户自行测试。

BeyoIHC™系列抗体配套提供了免疫染色一抗稀释液，可以用于IHC检测或其它适当用途时的一抗稀释。为进一步提高信噪比，推荐使用QuickBlock™免疫染色一抗稀释液(P0262)、SignalUp™免疫染色一抗稀释液(P0277)用于IHC检测。

抗体详细信息如下:

About this Antibody
Name	BeyoIHC™ CD146 Rabbit Monoclonal Antibody
Category	Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (mAb); Primary antibody; IHC抗体
Isotype	IgG
Clone number	BA1124
Purification method	Protein A affinity purification
Positive samples	-
Cellular location	Membrane
Customer validation	-
Epitope retrieval	Heat induced epitope retrieval with Tris-EDTA buffer (pH 9.0).
About the Immunogen
Immunogen	Full length rprotein (purified) corresponding to Human Human CD146.
Sequence	-
Gene ID	4162
SwissProt	P43121
Synonyms	CD146; HEMCAM; METCAM; MUC18; MelCAM; MCAM
Category	Stem Cell & Lineage Markers; Notch Signaling
Background	Melanoma cell adhesion molecule (MCAM, MUC18, CD146) is an immunoglobulin superfamily member originally described as a cell surface adhesion protein and marker of the progression and metastasis of melanoma. Expression of MCAM protein is seen in vascular endothelial cells, activated T lymphocytes, smooth muscle, and bone marrow stromal cells. Research studies demonstrate increased MCAM expression in endothelial cells from angiogenesis-related disorders, including inflammatory bowel disease, Crohn’s disease, rheumatoid arthritis, tumors, and chronic renal failure. MCAM-expressing human mesenchymal stromal cells (hMSC) in the hematopoietic microenvironment are responsible for maintaining the self-renewal of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) through direct contact between hMSC and HSPC. Related studies suggest that activation of the Notch signaling pathway may also, in part, play a role in HSPC maintenance. Additional research indicates that MCAM may play a role in multiple sclerosis, an autoimmune inflammatory disease that affects central nervous system neurons. Endothelial MCAM within the blood-brain barrier act as adhesion receptors that permit lymphocytes to transmigrate across the barrier and produce the inflammatory lesions that characterize the disorder.

包装清单： 保存条件：

-20℃保存，一年有效。免疫染色一抗稀释液也可以4℃保存，长期不使用推荐-20℃保存，但冻融可能会导致出现轻微的浑浊和少量不溶物。

注意事项：

如果本抗体用于免疫组化(IHC)等实验，请注意回收使用过的稀释抗体。回收的抗体通常可以重复使用1-5次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，请4℃保存。

回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10,000×g离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。

提供的免疫染色一抗稀释液也可以用于Western blot (WB)等适当用途。如果希望获得最佳的检测效果，推荐使用Western一抗稀释液(P0023)。

抗原修复过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
请根据抗体的实际用途选择相应的使用方法。相关步骤仅供参考，实际可尝试使用实验室习惯方法或根据实验目的进行条件的优化。
1. 免疫染色：
a. 石蜡切片样品的准备(Sample preparation)
(a) 脱蜡：将切片放入二甲苯中脱蜡5分钟，更换成新鲜的二甲苯再脱蜡5分钟，无水乙醇5分钟，更换成新鲜的无水乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，80%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟，蒸馏水洗1-5分钟。
(b) 抗原修复：一般使用加热抗原修复(Heat-induced epitope retrieval, HIER)的方法进行抗原修复。根据不同的抗原和抗体，可以选择抗体详细信息表格中建议的抗原修复液，或碧云天的Tris-EDTA抗原修复液(50X, pH9.0) (P0084)、EDTA抗原修复液(50X) (P0085)、柠檬酸钠抗原修复液(50X) (P0081)及其它抗原修复液(P0083/P0086/P0088)中。直接取适量抗原修复液于适当容器(例如染色缸等)中，抗原修复液以没过切片为宜，加热至沸腾后将放有切片的染色架浸入修复液中，持续加热15分钟后关火。或者在微波炉内进行抗原修复，抗原修复液以没过切片为宜，中火10分钟至沸腾，停火10分钟保温再转中低火7分钟。自然冷却至室温后，取出切片置于免疫染色洗涤液(P0106)或PBS (C0221A)中洗涤3次，每次5分钟。切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈。
b. 封闭(Blocking)
首先加入内源性过氧化物酶封闭液(P0100A)，室温封闭5-10分钟后，吸尽内源性过氧化物酶封闭液，蒸馏水冲洗，PBS清洗5分钟，共清洗两次。加入免疫染色封闭液(P0102)或QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)，室温封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
注1：从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
注2：在整个免疫染色过程中推荐使用碧云天的BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品。如果样品比较容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。
c. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
(a) 参考一抗的说明书，按照适当比例用提供的免疫染色一抗稀释液或QuickBlock™免疫染色一抗稀释液(P0262)稀释一抗。
(b) 用微型台式真空泵(E0110/E0113)等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温在摇床上缓慢摇动孵育0.5-1小时，如果一抗孵育1小时效果不佳可4℃孵育过夜。
(c) 回收一抗。加入免疫染色洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
d. 二抗孵育(Secondary antibody incubation)
(a) 参考二抗的说明书，用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)或QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液(P0267)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0216)等。也可根据具体实验情况使用生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗，以上二抗可向碧云天订购。
(b) 吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温避光孵育0.5-1小时，若短时间二抗孵育效果不佳，可适当延长二抗孵育时间。
(c) 回收二抗。加入免疫染色洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
e. 蛋白检测(Detection of proteins)
使用DAB法显色，如DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(P0202/P0203)，按照说明配制DAB染色工作液，加入适量DAB染色液，确保能够充分覆盖样品样本，避光室温显色3-30分钟，根据实际情况在显微镜下观察显色状态调整样本染色时间。也可根据具体实验情况选择辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303/A0305)、碱性磷酸酯酶标记Streptavidin (A0312)、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(C3206)、SABC-HRP Kit (P0603/P0612/P0614)或SABC-AP Kit (P0606/P0625/P0628)等进行检测。如有需要复染，可使用苏木素染色液(C0107)孵育3-5分钟，后续进行分化、冲洗返蓝。
f. 镜检拍照(Microscopic examination and photography)
依次将切片放入95%乙醇浸泡脱水30秒，更换新鲜95%乙醇浸泡脱水30秒，无水乙醇浸泡脱水1分钟，更换新鲜无水乙醇浸泡脱水1分钟，二甲苯中透明5分钟，更换新鲜二甲苯透明5分钟，共透明三次。使用中性树胶封片，室温风干后，光学显微镜下拍照。
2. 其它实验操作请自行参考适当的protocol进行。
3. 本抗体相关应用的代表性图片请参考下图。

Immunohistochemistry of formalin fixed paraffin embedded human placenta using BeyoIHC™ CD146 monoclonal antibody at dilution of 1:200.
参考文献：
1. Weber J, Peng H, Rader C. Exp Mol Med. 2017. 49(3):e305.
2. Seeber S, Ros F, Thorey I, Tiefenthaler G, Kaluza K, et al. PLoS One. 2014. 9(2):e86184.
3. Zhang Z, Liu H, Guan Q, Wang L, Yuan H. Front Immunol. 2017. 8:494.
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