一般来说，影响细胞培养的因素有很多，下面我们分为几个小专题和大家分享一下。

1.血清篇	2.添加剂篇	3.细胞传代篇
4.细胞冻存篇	5.细胞污染篇	6.原代细胞篇

血清篇

血清的热灭活：
灭活方法：56℃灭活30min。灭活后，血清的外观会发生变化，沉淀物显著增多。热灭活主要是灭活补体系统，因为激活的补体系统会激活淋巴细胞和巨噬细胞。原代细胞和免疫细胞建议热灭活血清。

血清的沉淀：
血清沉淀主要是血清中的各种蛋白、磷酸钙和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白、玻连蛋白等）引起，不会影响血清质量，使用时可以2000rpm
离心5分钟，取上清使用。

可能会增加血清沉淀的操作：1、热灭活；2、37℃培养；3、反复冻融；4、伽马射线照射；5、2-8℃长期保存；6、长期保存于可自动化霜的冰箱中（温度不稳定）。

血清保存：
建议血清保存于-20℃冰箱中，分装使用，如果存放在4℃，请勿超过一个月。

血清的选择：
血清为细胞的繁殖提供必须的生长因子，同时也是矿物质、脂类及激素的来源。最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和马血清等。牛血清是按照采血时间的早晚来分类的。采血时间越早，营养物质越丰富，所含抗体也越少，因而胎牛血清适合要求高的细胞系和克隆化培养。 血清批次间的差别是不可避免的，建议您一旦选定了某个批次的血清，最好备货，避免以后的麻烦。

添加剂篇

平衡盐溶液
平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成；它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养；同时用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。

PBS磷酸盐缓冲液： 碧云天生产的PBS (Phosphate-Buffered Saline)，含135mM NaCl, 4.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM NaH₂PO₄，pH值为7.4，经过灭菌处理。
用途：用于细胞培养过程中细胞的洗涤或其他常规用途。

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D-PBS：碧云天生产的D-PBS溶液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)，含2.67mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄, 137.93mM NaCl, 8.06mM Na₂HPO₄，pH值为7.4，经过灭菌处理。
用途：不含钙、镁离子，多用于胚胎学方面的研究，常用于胚胎的冲洗液，冻存液和培养液。

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Hank’s平衡盐：碧云天生产的Hanks' Balanced Salt Solution，简称HBSS，含137.93mM NaCl, 5.33mM KCl, 4.17mM NaHCO₃, 0.441mM KH₂PO₄, 0.338mM Na₂HPO₄, 5.56mM D-Glucose。经过无菌处理。
用途：可用于在大气环境下维持细胞生理 pH 的缓冲液，用于细胞培养过程中细胞的洗涤等常规用途。

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缓冲液
绝大多数细胞的最佳生长条件是pH 6.8-7.8。多数培养基利用碳酸氢钠进行缓冲，碳酸氢钠的缓冲需要二氧化碳。 NaHCO₃溶液：碧云天生产的7.5% NaHCO₃溶液(Sodium Bicarbonate Solutioin)用水配制，已经过过滤除菌。
用途：常用于细胞培养过程中调节培养基pH值。

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细胞传代篇

胰酶消化细胞：
a.吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。
b.加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。不同的细胞消化时间有所不同。
c.显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。
d.如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。
如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞消化液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

对于比较难消化的细胞，比如结肠癌细胞HCT116，HCT15，KM12，这些细胞一般需要少量的胰酶孵育，以恰好覆盖细胞为宜，时间在5min左右，细胞呈流沙状移动，即可终止消化。对于难消化的细胞，一般在trypsin中添加一些EDTA。

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细胞冻存篇

细胞冻存遵守慢冻速融原则。细胞在冻存时，细胞冷到0℃以下，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞中形成冰晶，大的冰晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂，因此需要慢冻，防止大的冰晶产生；快融是防止小冰晶重结晶形成大冰晶。常用的低温保护剂是DMSO，是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，使水渗透到细胞外形成冰晶。细胞冻存液主要成分是高糖DMEM、适量澳洲进口优质胎牛血清及DMSO。

细胞冻存步骤：胰酶消化细胞--吹打成细胞悬液--离心获取细胞沉淀--添加冻存液--程序性降温冻存细胞--做好冻存记录。

注意事项：1、0至-60℃是低温损伤发生的主要温度范围，被称为“危险温区”，细胞短暂放置后应立刻转移到-80℃，长期保存需要转移到液氮罐中，并定期检查液氮罐，及时添加。

细胞冻存液：http://www.beyotime.com/product/C0210.htm

细胞冻存盒：http://www.beyotime.com/product/FCFC012.htm

细胞污染篇

养细胞最头痛的就是遇到污染问题，总是让你猝不及防，又无从寻找原因。现整理一些细胞培养过程中常遇见的污染问题，供君参考。

细胞污染根据污染源的不同主要分为3类：化学性污染、物理性污染和微生物污染，其中微生物污染是最常见也是最严重的，一旦发生，无法挽救，只能将细胞丢弃。下面简单介绍一下常见的微生物污染。

霉菌污染：霉菌污染种类很多，多为曲霉菌、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。

污染源：实验人员（实验服）
霉菌污染后短期内不会引起培养液的浑浊，会在培养液中形成白色或淡黄色漂浮物，一般肉眼可见，易被发现。4d左右倒置显微镜下可以观察到纵横交错的菌丝。
酵母污染更容易观察，培养物变浑浊，显微镜下可以观察到卵圆形或球形颗粒，散在细胞上及细胞周边生长，有些会芽生较小颗粒。
确认是霉菌污染后，需要将细胞直接丢弃，将实验环节彻底消毒处理。

细菌污染：
常见的细菌污染主要是大肠杆菌、假单胞菌、 葡萄球菌等，其中革兰阳性菌较为多见。

污染源：操作不当或是器材消毒不严，或是各种营养成分隐性污染细菌没有被检测出来所造成的。
污染速度快，多数情况下细胞培养液短时间内变黄，pH值降低，明显浑浊，倒置显微镜下观察，细胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从壁上脱落，细胞培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，呈细沙状，细胞间可以观察到菌体存在。必要时可以取少量培养液接种到细菌培养板或细菌培养基中培养、检测。一旦发生细菌污染，早期时可以增大双抗的使用倍数，用药24-48小时后更换成常规培养基，污染晚期，细胞需要弃掉，复苏新的细胞。

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支原体污染：
污染源：血清
大小介于细菌与病毒之间的无细胞壁的原核细胞，对抗生素不敏感，可穿过0.22 μm 的孔径滤膜，不能用肉眼或光学显微镜检测，在细胞培养过程中是最容易忽视的一类污染。

支原体污染早期，细胞没有明显的变化，只有污染严重后，细胞增殖速度降低，细胞脱落。并且支原体可以通过移液、倾倒液体时产生具有潜在感染力的飞沫和吸附的尘埃，沉积在物体表面，污染操作环境，引起交叉感染和再次污染。怀疑支原体污染，可以使用支原体检测试剂盒进行检测。

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污染较轻时，使用支原体去除试剂盒进行处理

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同时严格清理实验操作环境。
ps:从外部获取的细胞请记得要进行支原体污染检测呦！

黑胶虫污染：
黑胶虫是学术界争议比较大的一类污染，不能确定是生物还是非生物，可以穿透滤膜，也可以通过空气传播。
污染源：血清
开始污染时对细胞无影响，当达到一定数量时会抑制细胞生长，培养基没有变化，显微镜下可以观察到点状或片状游动小体。细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

病毒污染：
病毒污染不会影响细胞的传代培养，但生产疫苗是不安全的。
污染源：动物血清或者细胞系，常见于杂交瘤细胞。
病毒污染极为隐蔽，很难检测。细胞液没有变化，大多数受病毒污染的细胞也不会产生形态变化及细胞病理现象，仅有少部分病毒会造成细胞变圆、肿胀，脱落。 怀疑发生病毒污染可以用血细胞吸附试验、免疫荧光抗体法及电子显微镜法有效检出病毒。通常病毒污染的清除是十分困难的，可以重新引入高质量的细胞株。

非同种细胞污染：
即细胞交叉污染，由于在培养过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。细胞发生交叉污染后由于难以分离细胞，所以一般是丢弃细胞，重新获取实验所需细胞。 所以在吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

原代细胞篇

注意事项：
原代细胞是刚从体内取出的组织中获得的细胞，要求不严格的话，十代以内都算原代细胞。因为离体时间短更能接近体内状况，同时对体外培养条件更加苛刻，需要更接近体内环境培养条件。

1、计数前，注意吸尽平皿里的细胞，充分混匀，使细胞分散成单个细胞，每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。
2、原代细胞未经永生化处理，因此群体倍增次数有限。为了防止遗传上的变化，最好尽快开始做实验。另外，为了防止混入杂细胞比例的增加，要经常观察细胞形态。
3、原代细胞再冻存后，细胞会老化，也可能引起机能变化，所以不建议冻存。细胞冻存也是细胞死伤的主要原因。
4、如果DMSO的浓度足够低，不会对细胞造成伤害，复苏原代细胞建议用带有血清的完全培养基溶解后铺瓶，第二天换液去除DMSO。
5、原代细胞传代时，要用低浓度的胰酶消化，在显微镜下看到细胞开始变圆、脱落后迅速终止胰酶。建议采用含10%血清的完全培养基作为胰酶终止剂终止消化。